Jak2v617f基因过表达及SAA患者血清对小鼠32D细胞体外培养中细胞因子浓度影响.docVIP

Jak2v617f基因过表达及SAA患者血清对小鼠32D细胞体外培养中细胞因子浓度影响 　　[摘要]目的观察Jak2v617f转染小鼠32D细胞后，与重症再生障碍性贫血患者（severe aplastic anemia，SAA）血清共培养，了解Jak2v617f对SAA患者血清细胞因子水平的影响。方法利用DNA克隆技术，将mutJAK2（v617f）慢病毒转染至32D细胞，检测未转染组与转染组细胞分别与正常血清与SAA患者血清培养后，血清细胞因子（IL-2、CD69、IFN-γ、TNF-α）水平的变化；同时观察未转染组细胞与SAA患者血清培养，加入Jak2抑制剂AZDl48后，上述血清细胞因子水平的变化。结果SAA组（SAA血清+32D）与对照组（正常血清+32D）比较，血清细胞因子CD69差异无统计学意义（P0.05），SAA组IL-2、IFN-γ则下降（P0.05）；AZD148组（正常血清+32D+Jak2抑制剂）与对照组比较，除CD69（P0.05）外，余细胞因子均较对照组减少（P0.05或P0.01）；SAA+AZDl48组（SAA血清+32D+Jak2抑制剂）与对照组比较，除CD69较对照组显著升高（P0.01）外，余均显著减少（P均《0.01）。结论小鼠32D细胞Jak2v617f基因的过表达，有利于弥补SAA血清细胞因子的消耗：小鼠32D细胞加入Jak2抑制剂则有可能加重SAA血清细胞因子的消耗。 　　[关键词]Jak2v617f；转染；SAA；细胞因子；AZD148 　　[中图分类号]R556.5 [文献标识码]A [文章编号]1673-9701（2016）04-00019-06 　　Jak2v617f基因突变多见于BCR-ABL阴性的骨髓增殖性肿瘤（myeloproliterative neoplasms，MPN），该病的临床表现主要有白细胞增多、血红蛋白增多及血小板增多等多血症的表现，也可出现血栓及出血；再生障碍性贫血的临床表现则刚好相反，它主要表现为白细胞减少、血红蛋白减少、血小板减少等骨髓衰竭的表现。Jak2v617f是骨髓增殖性肿瘤的致病因素，而细胞因子则是再生障碍性贫血的致病因素田。本文探讨将此两种致病因素加以整合，能否将两者的致病作用相抵消，现报道如下。 　　1资料与方法 　　1.1临床资料 　　选择2012年6月～2015年3月我院初治的SAA患者血清6例，均符合《血液病诊断及疗效标准》（第3版）中的诊断标准。其中，男3例、女3例，年龄22～45岁。同期选择我院健康体检者血清6例，其中男3例、女3例，年龄25-45岁。 　　1.2实验材料 　　mutJAK2（v617f）慢病毒由广州莱德尔生物科技有限公司协助制备；小鼠32D细胞由广州莱德尔生物科技有限公司提供；实验试剂：胎牛血清（Hyclone，Cat.No.SH30087.01），RPMI-1640培养基（Hyclone，Cat.No.SH30809.01B）；Mouse IL-2 Platinum ELISA（ebioscience，Cat.No.BMS601）；Mouse 　　CD69 　　HatinumELISA（ebioscience，Cat.No.BMS614/2）；Mouse IFN-γPlatinum ELISA（ebioscience，Cat.No.BMS606）；Mouse丁NF-αPlatinum ELISA（ebioscience，Cat.No.BMS607/3）。 　　1.3实验仪器 　　苏州安泰洁净工作台（SW-CJ-IFD），低速离心机（中佳，SC3614），倒置光学显微镜（OLYMPUS CKX41，U-CTR30-2），细胞恒温培养箱（Thermo scientific，HERACELLl50i），倒置荧光显微镜（Leiea，DM16000B），流式细胞仪（BD，calibur）。 　　1.4实验方法 　　感染实验：将2×104L个32D细胞接种于96孔板，体积为100μL，以第2天密度约50%左右为宜，37℃培养过夜；次日，从冰箱取出mutJak2（v617f）慢病毒，并在37℃水浴中快速融化（轻轻晃动约几秒，以溶化液体中有少量冰块为宜，立即取出），并立即用事先加热到37℃的新鲜完全培养基（使用前加入Polybrene，终浓度6 mg/mL）加入2×106 TU病毒（病毒浓度由预实验确定），轻轻混匀；吸去32D细胞原有培养基，将稀释好的病毒液加入细胞中；轻摇匀，37℃培养过夜；感染后第2天，吸去含病毒的培养液，换上新鲜的完全培养液（不含Polybrene），继续37℃培养；感染后第3天，观察GFP表达。另外，分别将2×105 L个32D细胞接种于24孔板，按上述步骤加入慢病毒