试验名称螺旋体检验.DOCVIP

PAGE PAGE 3 课程名称：微生物学检验技术 授课专业：医学检验 学时：2学时 实验二十六 螺旋体检验 (Spirochete Test) 一、实验目的 ⒈掌握几种病原性螺旋体的形态特征。 ⒉掌握螺旋体暗视野及Fontana镀银染色检查法。 ⒊掌握梅毒螺旋体的血清学初筛实验。 二、实验物品 ⒈菌种：钩端螺旋体液体培养物。 ⒉试剂：Fontana镀银染色液 ⒊示教片：钩端螺旋体，梅毒螺旋体，奋森氏螺旋体示教片。 ⒋其他：甲苯胺红试剂，待检血清标本，载玻片，暗视野显微镜等。 三、实验内容： ㈠标本采集 1.钩端螺旋体病人标本包括血液、尿液和脑脊液等。发病10天内取血液，二周后取尿液，有脑膜刺激症状者取脑脊液。 2.梅毒螺旋体标本采集： Ⅰ期梅毒病人取硬下疳渗出液，Ⅱ期梅毒取梅毒疹渗出液或淋巴结抽出液；对期梅毒末期以后(大约感染3-4周以后)的病人可分离血清检查有无梅毒螺旋体抗体和反应素。 ㈡形态观察及示教 1.螺旋体形态学观察 ⑴钩端螺旋体镀银染色： 镜下背景为淡黄褐色至棕黑色，菌体为棕褐色，一端或两端呈钩状弯曲，珍珠点状连接成型或C形螺旋体，螺旋不太清楚，表题整齐，粗细均匀。 ⑵梅毒螺旋体镀银染色与钩端螺旋体呈色相似，其特征是小而纤细，两端尖直，有8-12个规则，弯曲且缠绕紧密的螺旋 ⑶奋森氏螺旋体墨汁负染色 背景为黑色，奋森氏螺旋体不上色，螺旋稀疏，有4-8个螺旋，不规则，呈波纹状 2.暗视野显微镜观察（示教） ⑴步骤 ①取钩端螺旋体培养物制成压滴标本。 ②在暗视野集光器上加镜油，玻片置载物台上，上升集光器使镜油与玻片接触，先用低倍镜对光，使标本中物体观察清楚为止，再在标本上滴加镜油，用油镜观察。 ⑵结果：黑暗背景下螺旋体闪烁发光，运动活泼，翻转、滚动等运动。 ㈢操作 1.Fontana 镀银染色 ⑴染色液配制： ①固定液：冰醋酸1ml，甲醛2ml，蒸馏水100ml。 ②媒染液：鞣酸5g，石炭酸1g，蒸馏水100ml。 ③硝酸银溶液：硝酸银5g，蒸馏水100ml。 用前取银溶液20ml，逐滴加入100g/L氢氧化铵，至产生棕色沉淀，轻摇后溶解，微呈乳白色。 ⑵方法 ①涂片干燥 ②加固定液 ，固定1min后，用水冲洗 ③加媒染剂，加温至有蒸汽出现，作用0.5min ，水洗 ④加硝酸银染液微加温，染色0.5min，水洗待干，镜检。 ⑶结果：螺旋体染成棕褐色/黑褐色。 3.梅毒螺旋体的血清学试验—甲苯胺红不加热血清法 ⑴原理：将牛心肌的类脂质抗原（与梅毒螺旋体有共同抗原）吸附在甲苯胺红试剂上，以此作为诊断试剂，检测梅毒病人血清中的反应素，当血清与甲苯胺红试剂混合，如出现红色凝集为（+）。此法可进行半定量检测，快速、简便，适于梅毒初筛。 ⑵方法： ①待检血清、阳性对照血清、阴性对照血清各50ul，加入卡片的圆圈内 ②在每份血清上滴加1滴甲苯胺红试剂 ③100rpm，旋转摇动卡片8min，立即观察结果。 ⑶结果：出现红色凝集为（+）。 ㈣梅毒螺旋体确证试验——荧光密螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）（了解） 原理：待检血清→非致病性螺旋体吸收（除去非特异性抗体）→+梅毒螺旋体抗原+荧光素标记抗体（抗人IgG） 四、实验安排 ㈠形态示教观察 ㈡暗视野显微镜操作练习 ㈢示教梅毒螺旋体的血清学试验—甲苯胺红不加热血清法 ㈣每人1张玻片进行Fontana 镀银染色； 1张玻片取牙垢做墨汁负染色查奋森氏螺旋体 五、实验准备 ㈠示教片 钩端螺旋体 梅毒螺旋体 奋森氏螺旋体 ㈡暗视野显微镜操作 暗视野显微镜 钩端螺旋体培养物；6管/班 ㈢甲苯胺红试剂 ㈣Fontana 镀银染色 Fontana 镀银染色液：3套/班 玻片 夹子 ㈤墨汁