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一个木薯候选STK类抗病基因分离及其生物信息学分析 　　摘 要 根据丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类（STK）结构域Ⅰ和Ⅷ氨基酸保守序列设计了1对简并引物，以细菌性萎蔫病抗/感木薯种质E1340和GR911基因组DNA为模板，通过PCR扩增，均获得大小约0.5 kb的扩增片段。两个片段纯化、克隆、测序后获得完全一致的505 nt序列，比对发现，木薯种质AM560带有和该序列高度同源的核苷酸片段。对包括同源片段上下游各约2.0 kb的大片段序列进行基因预测，获得1个有4个外显子、ORF全长1866 nt的预测基因，命名SSK1。序列分析表明，该基因编码621 aa，有细胞壁受体激酶结合、偶联位点和8个跨膜结构域，具有典型的STK类抗病基因的保守结构，是一个候选的抗病基因，可能在木薯抗病反应中发挥重要作用。 　　关键词 木薯 ；候选抗病基因 ；丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 　　中图分类号 S533 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.12.006 　　木薯（Manihot esculenta Crantz）为大戟科（Euphorbiaceae）木薯属（Manihot Mill.）灌木状多年生作物，是世界三大薯类（马铃薯、甘薯、木薯）之一，也是全球仅次于小麦、玉米、水稻、马铃薯、高粱的第6大粮食作物。木薯块根富含淀粉，是主要的收获物，是全球10亿人口日常生活中所需热能的主要来源。目前，木薯在我国华南地区广泛种植，以之为基础的食品和生物能源等产业是当地农业经济的重要部分[1]。木薯种植中，各类严重发生的病害是相关产业发展的限制性因素之一。国外报道为害木薯的病害多达30余种[2]。中国热带农业科学院环境与植物保护研究所的调查结果表明，危害中国木薯的病害有8种，其中细菌性萎蔫病最为严重[3]。种植抗病品种是作物病害防治中最为有效的措施之一，相关抗病基因资源是开展抗病育种工作的前提。目前木薯抗病机理方面的研究还很少，也缺少可供利用的基因资源，严重制约了相关研究工作的开展。 　　基因对基因假说[4]认为，寄主植物带有多个抗病基因，病原菌带有对应的无毒基因，二者的蛋白产物互作后通过一系列的级联反应调控植物表现出抗病性[5]。目前模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）和番茄（Lypoersicum esculentum）抗病基因方面的研究最多[6-8]。已克隆的抗病基因蛋白产物通常具有1种或多种保守结构，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（STK）结构域是抗病基因蛋白产物常见的结构之一。该类激酶作用方式包括蛋白质间相互作用，转录水平和翻译水平调控和DNA复制的调节等方式[9]。以抗病基因的保守结构域设计简并或特??引物通过PCR扩增或使用RGA探针从基因组DNA或cDNA文库中获得抗病基因类似序列，再从中筛选潜在的抗病基因，是作物抗性机理研究中的重要方法。本研究根据STK的保守区序列设计简并引物，通过PCR扩增获得木薯抗病基因类似序列并进行候选基因的分离和生物信息学分析，为进一步开展相关研究提供基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 供试木薯品种 　　木薯细菌性萎蔫病抗病种质E1340和感病种质GR911[10]，由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所木薯种质资源圃提供。 　　1.1.2 培养基和试剂 　　DNA 片段胶回收试剂盒、pMD18-T 载体购自宝生物工程（大连）有限公司。Taq酶、dNTPs和大肠杆菌Top10感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司。引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。大肠杆菌培养采用LB培养基（参照方中达[11]的方法制备），其他试剂均为国产分析纯。 　　1.2 方法 　　1.2.1 木薯基因组DNA的提取及目的序列扩增 　　田间采集健康木薯种质叶片，按闫庆祥等[12]的方法提取基因组DNA。根据小麦中与Lr10紧密连锁的一个STK激酶和水稻抗白叶枯病基因Xa21的STK激酶区保守氨基酸序列设计1对简并引物Ps-F（5′-GGNCARGGNGGDTTYGGDWSDG-3′）和Ps-R（5′-YTCNGGNGCDATRTADCCCATTG-3′）进行PCR扩增。 　　PCR反应体系：10×PCR缓冲液2.5 μL、10 mmol/L dNTPs 1 μL、10 μmol/L各引物溶液1 μL、DNA模板50 ng、Taq DNA 聚合酶1.0 U、补充无菌水至25 μL。PCR循环参数：94℃预变性3 min；94℃ 30 s、52℃ 30 s、72℃ 2 min，35 个循环；最后72℃延伸10 min。扩增产物用1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测后，按试剂盒说明书进行扩增产物的纯化、回收和克隆，随机挑选3个阳