MTT法检测纤维蛋白胶对人脂肪源干细胞增殖影响.docVIP

MTT法检测纤维蛋白胶对人脂肪源干细胞增殖影响 　　【摘要】目的：检测纤维蛋白胶对人脂肪源干细胞增殖的影响。方法：体外培养人脂肪源干细胞，取第三代细胞接种到96孔板，以不同浓度（纤维蛋白与凝血酶比例：4：1、2：1、8：3、5：2）的纤维蛋白胶浸润提取液培养，用MTT法检测脂肪源干细胞在不同浓度纤维蛋白胶上的增殖情况。结果：不同浓度纤维蛋白胶制备的浸泡提取液所培养的人脂肪源干细胞的生长曲线无明显差异。结论：不同浓度纤维蛋白胶对人脂肪源干细胞的增殖无明显影响，纤维蛋白胶有望成为人脂肪源干细胞生长的支架材料。 　　【关键词】纤维蛋白胶；人脂肪源干细胞；MTT法：组织工程 　　【中图分类号】R318 【文献标志码】A 【文章编号】1008-6455（2015）05-0037-03 　　纤维蛋白胶（fibrin glue，FG）是一种可降解、无毒的牛物蛋白制剂。对于组织工程基质材料的选择，目前所采用的可注射性材料有纤维蛋白胶、聚乙烯类水凝胶、聚乙烯醇一壳聚糖水凝胶、藻酸盐类、琼脂糖类、透明质酸类、壳聚糖衍牛物类等。纤维蛋白胶因其良好的牛物相容性，并能促进细胞如干细胞的黏附与增殖，被用作多种药物、细胞及细胞因子的缓释载体。脂肪源干细胞具有来源广泛、取材不涉及伦理问题、对患者创伤小、细胞获得量大、无排斥反应等优点，并具有多向分化的潜能，是理想的组织工程种子细胞。本实验丰要探讨纤维蛋白胶作为支架对于人脂肪源干细胞（humanadipose tissue-derived stem cells，ADSCs）增殖的影响，为人脂肪源T细胞作为种子细胞、纤维蛋白胶作为支架材料的组织构建研究奠定理论依据。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　DMEM高糖培养基（含青、链霉素）、磷酸盐缓冲液（PBS）、胎牛血清（Gibco公司，美国）、I型胶原酶（Sigma公司，美国）、胰蛋白酶（Gibco公司，美国）、MTT液、二甲基亚砜（DMSO）、纤维蛋白原（Sigma公司，美国）、凝血酶（Sigma公司，美国）。 　　1.2 脂肪源干细胞的分离、扩增 　　1.2.1 脂肪源T细胞的分离与培养：取脂肪抽吸术后的脂肪组织，组织来源于20～40岁女性患者，排除自身免疫性疾病、遗传病及其他恶性疾病，患者知情同意。注射器负压吸引法吸取脂肪组织20ml，PBS冲洗，去除肉眼可见的血管和纤维结缔组织，无菌镊子、剪刀剪碎脂肪；将处理好的组织移入50ml离心管，加入等体积0.075%I犁胶原酶于37℃条件下消化2h，期间不时振荡，使脂肪与酶充分接触；加入含15%胎牛血清的高糖培养基终止消化；1500rpm，5min；弃去漂浮的脂肪组织和上清，完全培养基制成细胞悬液；接种在lOmm培养皿中，在37℃、5%C02孵箱内培养，24h后观察细胞贴壁状态，进行第一次换液，弃原培养基和漂浮细胞，连续培养，2～3d换液。 　　1.2.2 脂肪源T细胞的扩增：待单层细胞融合率达到80%～90%时，用PBS清洗2次，加入1∶250胰蛋白酶（含EDTA）消化，当细胞变圆并部分脱落时，加入含15%胎牛血清的培养基终止消化，轻轻吹打培养区域；收集细胞悬液，以1∶2～3比例传代，2～3d换液；传至第3代备用。 　　1.3 支架材料的制备 　　纤维蛋白胶及其浸润提取液的制备：纤维蛋白原、凝血酶按不同比例混合（浓度4∶1、浓度2∶1、浓度8：3、浓度5：2），制成不同浓度的纤维蛋白胶。分别接种于96孔板中，每组各设6孔，1个丰孔，5个副孔，共4组。待形成具有固定强度的纤维蛋白胶后加入150ul DMEM培养液，放入37℃、5%CO2孵箱内静置48h制备不同浓度纤维蛋白胶的浸润提取液待用。 　　浸润提取液培养细胞：将第3代人脂肪源干细胞制成lXl03/150ul细胞密度接种于96孔板中，每孔加入150ul细胞悬液。每组各设6孔，1个丰孔，5个副孔，共4组，另设一组用常规培养基培养作为对照组。放入37℃、5%C02孵箱内24h，待细胞贴壁；弃原培养基，PBS清洗2遍，第一组加入纤凝比为4∶1的浸润提取液，第二组加入纤凝比为2∶1的浸润提取液，第三组加入纤凝比为8∶3的浸润提取液，第四组加入纤凝比为5∶2的浸润提取液，另设一组用常规培养基培养的细胞作为对照组，隔天换液。重复两次，结果行多样本X2检验。 　　1.4 检测方法 　　培养2、4、6、8、lOd后，各孔加入5mg/mL MTT液体15ul，继续培养4h。然后取出培养板，吸去孔内培养液，加入150u1 DMSO，酶联免疫检测仪自动振摇培养板Imin，以490nm为参考波长测定吸光度值（OD值）。 　　2 结果 　　通过酶联免疫检测仪测定的OD值进行绘图，以培养天数为横轴，OD值为纵轴，绘制牛长曲线。如图（图2）可见：