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siRNA沉默LAT2对RASFs侵袭影响 　　摘要：本文主要采用实时定量PCR法检测LATs（L-type amino acid transporters，LATs）家族成员在类风湿患者滑膜组织中的表达。利用人工合成的siRNA沉默LAT2基因，采用实时定量PCR法检测LAT2的沉默效率，采用 Transwell法检测沉默LAT2后对RASFs侵袭的影响。实验结果显示在类风湿滑膜组织中表达的LATs家族成员主要有LAT1、LAT2和LAT3，其中LAT2的表达明显高于LAT1和LAT3，在有效下调LAT2（P0.01）后发现与阴性对照组（NC对照组）相比细胞的侵袭能力明显下调（P0.01）。 　　关键词：siRNA；LAT2；类风湿滑膜成纤维细胞；侵袭 　　类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以关节滑膜炎症为主要特征的自身免疫系统疾病。其主要的病理特征为滑膜细胞异常增殖和炎性细胞侵润，侵袭软骨，破坏骨组织，严重时可致残[1]。目前RA已成为危害人类健康的重要疾病之一，但其病因尚不清楚。已有研究证实，RA成纤维样滑膜细胞（rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes， RASFs）作为RA的主要效应细胞，在RA的发病过程中发挥着重要作用[2～4]。并且在发病过程中RASFs表现为过度增殖、凋亡不足、炎性因子分泌过多等生物学特征[5，6]，但其具体机制尚需探索。 　　LAT2 （L-type amino acid transporter2，LAT2）是一种非Na+依赖的氨基酸转运载体，存在于细胞膜表面，与4F2的重链共价连接发挥生物学功能[7～9]。有文献报道，LAT2主要表达于小肠、肾脏、大脑、胎盘、卵巢、睾丸、骨骼肌和胰腺[10]。细胞的增殖分化离不开氨基酸，而LAT2作为氨基酸转运载体在异常增殖和侵袭的RASFs中发挥重要的作用。但目前LAT2在RASFs中仍未见相关报道。本研究通过对RASFs中高表达的LAT2进行有效下调，探究其对细胞侵袭的影响，以期能够加深对RA发病机制的了解。 　　1 材料与方法 　　1.1主要试剂 高糖DMEM培养基、胰蛋白酶购于美国Corning公司；胎牛血清、Ⅱ型胶原酶购于美国Gibco公司； MTS购于美国Promega公司；HiPerFect转染试剂购于德国Qiagen公司；TRIzol Reagant 购于美国Invitrogen公司；SYBR Green 购于德国Roche公司； Transwell小室购于美国BD（Becton， Dickinson and Company）公司。 　　1.2主要仪器 LightCycler480 Thermocycler购于德国罗氏公司；PCR Thermal Cycler购于日本TakaRa公司；倒置显微镜购于日本Nikon公司Synergy HT酶标仪购于美国Bio Tek公司。 　　1.3原代细胞培养 本文所有样本来自山东省立医院，所有样品均经患者知情并同意，并经山东省立医院院伦理委员会通过。RA患者膝关节滑膜组织用Hanks平衡盐溶液冲洗5～10次，将组织充分剪碎分装于培养皿中，加入4ml DMEM培养基和120μL二型胶原酶，37℃，6h。消化充分后加入3mL无EDTA的胰酶，进行吹打、消化、过筛。过筛后的细胞悬液收集与离心管中，1500r/min，离心5min。弃上清液，沉渣混匀培养至 37℃、5% CO2培养箱内培养。 　　1.4采用Trizol法提取细胞或组织中的RNA 向组织或者细胞中加入Trizol反复吹打均匀；再加入氯仿（每500μL Trizol加入200μL氯仿），剧烈震荡15s，4℃静置15min，12000r/min，4℃离心15min，取上清于1.5ml离心管中，加入异丙醇250μL，震荡15s，4℃静置10min。12000r/min，4℃离心10min，弃上清，加入500mL无水乙醇混匀，洗涤RNA。12000r/min，4℃离心5min，弃上清，室温干燥5～10min。 　　1.5采用实时荧光定量PCR检测mRNA的表达 ①根据Solabio反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA。②反应体系（10μL）：5μL上样缓冲液，1μL上游引物，1μL下游引物，1μLcDNA，2μL去离子水。反应条件：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火10s ，45个循环；72℃延伸10s。mRNA 相对表达量采用比较阈值周期（Ct）方法分析。以GAPDH为内参进行标准化。 　　1.6细胞瞬时转染 将RASFs以2×105个/孔接种于12孔板中。根据HiPerFect转染试剂说明书进行瞬时转染，实验分为3个