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3D重组皮肤模型研究进展与OECD新规 　　在众多的人类组织工程学体外模型皮肤中，皮肤组织的三维（3D）重组模型是其中最完善的模型之一。制药业和化妆品行业对于动物模型的替代方法巨大的需求，推动了皮肤模型的发展进步。2013年7月26日，经济合作与发展组织 　　（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）再次更新试验指南TG43l和TG439，对于使用3D皮肤模型进行体外皮肤腐蚀性、刺激性试验，提出更具体的要求。本篇综述重点介绍由角质细胞构成的重组表皮模型（Reconstructed Human Epidermis Made of Keratinocyte，RHE），概述其检测原理，以及OECD对于应用此类体外模型的最新标准。简单介绍其他种类的皮肤模型，并对我国目前动物试验替代方法的研究成果和前景进行讨论和总结。 　　关键词：皮肤模型，动物试验替代方法，OECD规则 　　引言 　　皮肤作为人类最大的器官，包含多种类型的细胞，这些细胞相互影响，协同作用，构成阻挡有害物质进入机体的第一道天然屏障。角质层作为皮肤屏障作用的主要执行者，是由表皮层基底的角质细胞不断分化而来（如图1）。在表皮层中，除了角质细胞，还有黑色素细胞和朗罕氏细胞。表皮层通过一层基膜与其下面的真皮层相连接。真皮层分为乳突层和网状层，前者含有的胶原纤维排列疏松，后者的胶原纤维排列致密并且与皮肤表面平行。这些胶原纤维由成纤维细胞产生，含有大量的弹性蛋白，为皮肤提供弹性。不同于表皮层没有血管的结构，真皮层内富含血管、淋巴管、神经、汗腺、皮脂腺和毛囊。 　　皮肤的疾病可能由多种原因造成，比如细胞代谢紊乱、传染病，对外界抗原的免疫性反应或是物理性、化学性的伤害。病因的多样性和复杂性使得在药物研发领域，对于体外皮肤模型的需要日益增长。另外，出于法律和道德的要求，国外化妆品行业同样重视体外皮肤模型的使用。2013年7月26日，经济合作与发展组织（Organization for Economic Co-operation andDevelopment.OECD）再次更新试验指南TG431和TG439（以下简称2013版指南），对于体外皮肤腐蚀性、刺激性试验提出更详尽的要求。 　　大量的研究促使人类皮肤模型不断进步，从依靠滋养层培养到表皮替代物以及多种类型细胞共培养系统。目前皮肤模型主要分为两大类，一类是致力于开发更为精细复杂的皮肤模型，用于皮肤疾病的治疗，培养条件和结果判定也相应的更复杂。已经建立的比较好的模型是包含有角质细胞和成纤维细胞的全皮模型（fullthickness.FT），还有更为复杂的加入了其他类型细胞（如黑色素细胞，干细胞，朗罕氏细胞）或者可以与其他器官相互作用的模型。第二类则是已经进入量产并且经过验证的由角质细胞构成的重组表皮模型，主要用于风险评估，具有很好的可重复性。本文将重点讨论第二类皮肤模型，并简单介绍其他模型。 　　由角质细胞构成的重组表皮模型 　　1.概况 　　为满足研究者和工业界对于皮肤模型不同的需求，现有的皮肤模型有多种类型。最基本的是只含角质细胞的皮肤模型，即由角质细胞构成的重组表皮模型（Reconstructed HumanEpidermis Made of Keratinocyte.RHE）。RHE是在特定条件下培养人类角质细胞，并通过气液面培养的方式得到角质层，基本具有类似于人表皮的组织结构（如图2）。 　　1998年，首批皮肤模型（EpiSkin和EpiDermTM）被替代方法欧洲研究中心（EuropeanCentre for the Validation of AlternativeMethods.ECVAM）批准用于皮肤腐蚀性预测，并于2004年随着OECD试验指南的出版而在国际上被广泛接受。不久之后，其他满足经合组织试验指南要求的模型陆续被批准。2008年经过调整的EpiDerm SIT和SkinEthic被批准用于皮肤刺激性预测。 　　2.检测原理 　　RHE对于有潜在腐蚀性或刺激性物质的预测是通过检测细胞存活率的方法来实现。即待检测物质渗透至角质层以下的细胞层，如果对活细胞产生毒性作用，就会导致部分细胞死亡。使用3-（4.5-二甲基噻唑-2）-2.5二苯基四氮唑溴盐（简称MTT）检测，根据试验组吸光值（OD值）和阴性对照组的比值，确定细胞活率的变化。当待测物质对于活细胞有刺激作用时，细胞会分泌系列迅速引起皮肤炎症的因子，如IL-1α，对其定量分析可以辅助评估细胞受到刺激的程度和体外炎症起始的级联反应/作用机理。所以对于刺激性物质通常会选用MTT和IL-1α双终点判定。 　　3.OECD 2013版指南对于皮肤模型的基本要求