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一种重组人溶菌酶的纯化工艺研究 　　摘 要：目的：以毕赤酵母表达的重组人溶菌酶（hLYZ，以下简称hLYZ）发酵液为原料，建立一种hLYZ纯化方法。方法：高速离心技术、膜过滤技术，超滤技术为主的粗纯工艺；应用离子交换色谱的精细纯化工艺。结果：以该纯化工艺可生产获得单一组分的hLYZ，经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳及反相高效液相色谱C18柱检测其纯度可达98%以上。结论：本工艺得到的hLYZ纯度大于98%、可用于进一步工业化研究。 　　关键词：hLYZ；超滤浓缩；离子交换层析；纯化 　　中图分类号：Q55 文献标志码：A 文章编号：2095-2945（2018）06-0176-03 　　Abstract： Objective： to establish a method for purification of human lysozyme （hLYZ） from the fermentation broth of recombinant human lysozyme （hLYZ） expressed by Pichia pastoris. Methods： high speed centrifugation， membrane filtration and ultrafiltration were used for crude purification， and ion exchange chromatography was used for fine purification. Results： a single component of hLYZ could be obtained by this purification process. The purity of hLYZ could reach more than 98% by SDS polyacrylamide gel electrophoresis and RP-HPLC C18 column. Conclusion： the purity of hLYZ obtained by this process is more than 98%， which can be used for further industrial research. 　　Keywords： hLYZ； ultrafiltration concentration； ion exchange chromatography； purification 　　引言 　　溶菌酶（lysozyme）是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，又称胞壁质酶，溶菌酶广泛的存在于高等动物组织及分泌物、鸟类和家禽的蛋清中也含有此酶、其中以鸡蛋清中含量最高[1-2]。它是一种无毒、无副作用的蛋白质，具有一定的溶菌作用，可作为食品防腐剂。同时它具有抗菌、抗病毒等多种作用[3]。溶菌酶还具有破坏细胞壁结构的功能，因此溶菌酶成为基因工程及细胞工程必不可少的工具酶[4]。随着生物工程的迅速发展，溶菌酶应用价值将会越来越重要。目前用于溶菌酶分离纯化的方法主要有结晶法[5-6]、离子交换法[7-8]，特别是现在采用的新技术如膜分离技术[9-10]、超滤法、亲和-膜过滤技术等[11-12]。 　　与其他来源溶菌酶相比，人溶菌酶具有其优越性和多种药理作用，在临床上也具有重要价值。 因此分离纯化得到高纯度hLYZ，产品用于进一步科学研究就显得尤为重要。但天然溶菌酶来源及其困难，DNA重组技术进行生产是解决这一困难的有效途径，现已利用化学合成或从人细胞组织中制备cDNA等途径获取人溶菌酶基因，并在大肠杆菌，酵母菌等表达系统进行了表达，由于其表达水平不高，再加上后期纯化工艺损失，总体收益较低， 因此目前国内外对于hLYZ纯化工艺研究相对较少，本工艺运用固液分离技术，超滤技术、离子交换层析技术得到纯度大于98%的hLYZ产品，符合工业化生产要求，且工艺相对简单易操，可用于进一步的工业化研究。 　　1 材料和方法 　　1.1 仪器 　　辽阳阳光三足式离心机（SSC600-NG）、0.22um除菌滤器、天津膜天膜中空纤维膜组件、武汉新力协力超滤膜组件、AKTA purifiers 100、北京六一电泳仪、日立HPLC 、C18层析柱（中科院大连化学物理研究所）。 　　1.2 试剂及材料 　　（1）试剂。十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、氯化钠、氢氧化钠、盐酸以及电泳相关试剂均为国产分析纯；去离子水；超纯水；乙腈及三氟乙酸均为色谱纯；CM Sepharose Fast Flow（保赛恒成生产，批号。对照品LYZ：sigma Lysozme hunman（L1667）。（2）材料。本公司2017050