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三色堇DFR基因的克隆及表达分析 　　摘要：从三色堇花瓣中克隆了1个花色素合成结构基因的全长cDNA，命名为VwDFR。VwDFR cDNA全长为1 340 bp，编码347个氨基酸组成的蛋白，与胡杨的DFR序列具有较高的序列一致性。VwDFR蛋白含有典型的植物DFR蛋白的保守功能结构域，属于SDR超基因蛋白家族成员。VwDFR基因在三色堇不同组织中的表达存在明显差异，在初花期的花瓣中表达量最高，且色斑区高于非色斑区。结果说明，VwDFR可能与三色堇花色形成有关。此结果为深入研究三色堇花色形成奠定了基础。 　　关键词：三色堇；DFR；基因克隆；表达分析；花色素合成 　　中图分类号： Q785文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0034-04 　　收稿日期：2015-05-19 　　基金项目：国家自然科学基金（编号31260488）；海南大学中西部计划学科建设（编号：ZXBJH-XK008）。 　　作者简介：孙海燕（1986―），女，重庆开县人，硕士，从事园林植物资源与遗传改良。E-mail：shy0228@。 　　通信作者：王健，男，湖北宜昌人，博士，教授，硕士生导师，从事园林植物分子生物学。Tel：0898E-mail：wjhnau@163.com。花形态的多样性是大自然最美丽的礼物之一，总是令生物学家着迷。生物学家对产生花卉多样性的发育遗传机制进行了深入的研究，发现金鱼草和矮牵牛是探索花对称性[1]、花色[2-4]、花瓣纹理[5]的优秀模式植物。随着研究的深入，花斑的形成逐渐被学者关注。植物花斑是指在其花瓣大小、形态和位置上基本固定的色斑[6]，主要是由于花色素在特定区域积累形成的，如三色堇黄底紫斑品种Rhinegold和白底紫斑品种Mont Blanc的花斑部分的组成色素是飞燕草素和矢车菊素[7-8]。因而，花色素在花瓣上积累的分子机理是花斑形成原因的研究重点。 　　花青素又称花色素，属类黄酮化合物，是一类植物次生代谢产物，广泛存在于植物细胞液泡中。自然界中主要有6类花色素，即天竺葵色素（pelargonidin）、芍药花色素（peonidin）、矢车菊素（cyanidin）、牵牛花色素（petunidin）、飞燕草色素（delphinidin）和锦葵花色素（malvidin），其生物合成和调控已有较深入的研究。花青素生物合成途径的前体物质是 4-香豆酰CoA与3-丙二酰CoA，最后形成花的颜色涉及的一系列酶有：查尔酮合酶（CHS）、查尔酮异构酶（CHI），黄烷酮3-羟化酶（F3H）、二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）、花色素合成酶（ANS）和UDP-葡萄糖类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶（UFGT）等[9-10]。 　　二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）是花青素生物合成中类黄酮途径的第一个酶，负责将3种二氢黄酮醇（DHK、DHQ和DHM）还原为无色花色素苷，缺失DFR活性的突变体会产生白色。在一些植物中，DFR有严格的底物特异性，不能利用二氢堪非醇（DHK）生产天竺葵素，因而缺乏橙/砖红色。Johnson等将兰属DFR基因转入矮牵牛后，不能有效合成天竺葵素，而将非洲菊中能有效还原DHK的DFR导入到白色矮牵牛中，得到了砖红色花朵[11]。可见，围绕DFR基因进行基因操作也可以改造花色。 　　三色堇（Viola×wittrockiana Gams）是堇菜科堇菜属的一种多年生常作二年生栽培的草本花卉。由于其花色丰富、明艳，花期长，是花坛、花境、盆花等常用早春花卉，有“花坛皇后”之美誉，在园林绿化方面有很高的应用价值。鉴于DFR基因对植物色彩的形成非常关键，分离三色堇花瓣中DFR基因并研究其表达调控特点，将有助于阐明DFR基因在三色堇花斑形成过程中的作用。本研究拟从三色堇花瓣中克隆DFR基因的cDNA全长序列，进一步对VwDFR进行生物信息学及系统进化分析，并采用实时荧光定量PCR技术研究VwDFR在三色堇不同组织中的表达情况。 　　1材料与方法 　　1.1植物材料 　　本试验材料为花色黄底黑斑的三色堇（Viola × wittrockiana Gams）品种，种植于海南大学园艺园林学院基地。 　　1.2菌株与试剂 　　大肠杆菌Escherichia coli JM109菌株购自天根生化科技有限公司；反转录试剂盒（K1642）购自Fementas公司；DNA凝胶回收试剂盒购自Sigma公司；LA Taq DNA聚合酶、pMD18-T载体和实时荧光定量PCR试剂SYBR Premix ExTaqTM Ⅱ购自大连宝生物公司；引物合成和测序由上海英俊生物技术有限公司完成。其他生化试剂均为进口或国产分析纯试剂。 　　1.3方法 　　1.3.1