一组柑橘嫁接嵌合体及其嫁接亲本形态学遗传学研究.docVIP

一组柑橘嫁接嵌合体及其嫁接亲本的形态学、遗传学研究 　　摘　要：对一组柑橘周缘嵌合体(Ekuliku)及其嫁接亲本(Nankan和Hamlin)的叶片和果实进行了形态学、生理学及遗传学分析。一般柑橘嵌合体的不同部位由不同亲本特定的组织层发育而来。实验结果表明，嵌合体果实的特性并不与其同层亲本的特性完全一致，嵌合体叶片横截面的结构也与亲本存在较大差异，说明在细胞层间存在着一定的相互作用。用127种随机引物和1对STS特异性引物对嵌合体和嫁接亲本作遗传学分析，其中8种引物能得到特异性条带，即只在嵌合体和其中的1个亲本中检测到；并且这8个引物都有很高的重现性。随即，对这些特异性条带作了克隆、测序和同源性比较分析。 　　关键词：柑橘周缘嵌合体；遗传学分析；形态分析 　　中图分类号：S666　文献标识码：A　文章编号：1009－9980(2007)01－01－05 　　 　　根据“Tunica-Corpus”的理论，高等植物的顶端分生组织由3层组织细胞层组成。周缘嵌合体的3层细胞来自不同的亲本，因此，一般认为由不同层细胞演化形成的组织和器官能够反映该细胞层对应亲本的特性。对芸苔属植物、烟草、番茄等嵌合体的研究表明，在分生组织细胞分化阶段，细胞间的相互作用确实存在。基于这种相互作用，嫁接体不但可以从亲本中继承其优良品性，更可以创造出新的特性。因此嫁接虽然是一种古老的育种方法。但仍是一种理想的育种方法。 　　柑橘的食用部位由LI层细胞层发育分化而来，因此周缘嵌合体在实际应用中具有较大的价值。但由于细胞层间相互作用的存在，其食用部分也受到其他2层细胞的影响。为了更好的理解嫁接亲本对嫁接嵌合体的影响，以及细胞层间的相互影响，对柑橘嵌合体Ekuliku及其亲本Nankan、Hamlin做了遗传学、形态学和生理学的研究。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1．1　植物材料 　　嫁接嵌合体Ekuliku由Ll层亲本Nankan(Citrus unshiu)和L2、L3层亲本Hamlin(C.sinensis)嫁接而成，取果实和叶作为研究材料。 　　 　　1．2　形态学和生理学指标测定 　　使用Osaka EM，DTK-1000型微切片机切片，对叶片的横截面进行观察，具体方法参照Zhou等的方法，样本量则各为40枚。果实含糖量用折射仪(Brix0-20％)测得，嫁接嵌合体和亲本的取样量各为30个果。对结果进行显著性统计分析(LeastSignificance Difference Test，P=0.05)。 　　 　　1．3　RAPD分析 　　参考Dellaporta等方法提取叶中总DNA。PCR方法参考Zhou等的方法，并略有改进。PCR扩增程序为：94℃ 3min；94℃ 1min，37℃ 1min，72℃　2min，40个循环；72℃ 10min。若引物为STS标记引物，则扩增程序调整为：94℃ 3min；94℃ 0.5min，55℃ 0.5min，72℃ 1min，35个循环；72℃ 10min。 　　 　　1．4　对特异性条带的克隆和测序 　　对具有特异性的条带进行割胶纯化回收(GenecleanⅡ，BIO 101，INC,)，并将纯化产物插入pT7 blue T-载体(Novagen)中。连接后的载体再被转入感受态的大肠杆菌(Escherichia coli，DH5α)，培养后获得的质粒DNA用于测序。测序使用ThermoSequenaseTM cycle(Amashan)试剂盒，在自动测序仪(DSQ 1000 L；Simadzu)上完成测序。所测得序列在BLAST网站(/)上进行同源性比对。 　　 　　2　结果与分析 　　 　　2．1　果实的形态特征和生理特性 　　对果实的质量、高度、直径以及高度与直径的比值进行了调查(表1)。除高度外，其他特征嵌合体与亲本间都存在显著差异。Nankan的质量和直径显著大干Ekuliku和Hamlin，Ekuliku介于两亲本之间。但由于3者的高度几乎相同，使高度和直径的比值呈现相反的趋势，即HamlinEkulikuNankan。因此，在形状上也呈不同的形态，Nankan呈典型的扁圆体，Ekuliku和Hamlin为偏扁圆或偏圆。 　　 　　柑橘嵌合体果实的小汁胞(或称沙囊)由L1层细胞发育而来，而其外果皮(又称色素层或黄皮层)和中果皮(又称海绵层或白皮层)起源于L2层细胞层。图版―1显示了嵌合体的外果皮颜色与其L2层细胞层亲本Hamlin非常接近，都显橙色，而Nankan的外果皮色泽更偏红。果实的横剖面(图版―2)也显示了同样的效果，即嵌合体瓤囊(包括小汁胞和瓤?k壁)的颜色与其L1层细胞亲本Nankan瓤囊的颜色极为相似，都呈明显的橘红色，而