不同放牧强度下冰草自然居群遗传多样性分析.docVIP

不同放牧强度下冰草自然居群的遗传多样性分析 　　摘要：采用ISSR分子标记技术对不同放牧强度下冰草自然居群的遗传多样性进行了研究。结果表明，放牧导致冰草部分位点丢失，但整个冰草居群仍表现出丰富的多态性，ISSR检测的多态性条带比率为96.46%，居群间的遗传差异很小，放牧并未使冰草居群产生遗传分化。由Shannon’s和Nei’多样性指数检测的各个引物在4个冰草居群内的遗传多样性的大小排列顺序为：中度放牧样地重度放牧样地无放牧样地轻度放牧样地。 　　关键词：冰草居群； ISSR；放牧强度；遗传多样性 　　中图分类号：Q 786文献标识码：A文章编号2015 　　古、和中国北部最为丰富，是典型草原、荒漠草原和草原地区沙地及西北半农半牧区的常见牧草。 　　冰草属于优等牧草，具有抗旱、耐寒、耐碱、耐践踏、寿命长、分蘖能力强等特性，营养丰富，抽穗期营养价值最高，消化率高，草质柔软、适口性良好，在冬春饲草缺乏起着重要的作用。是放牧和打草兼用型牧草，并已广泛驯化栽培作为草地补播草种。 　　有关冰草遗传多样性的研究报道很多，阎贵兴＼[1＼]发现冰草属植物不同种间存在核型多型性；云锦凤等＼[2＼]对蒙古冰草B染色体进行了分析；解新民＼[3＼]对蒙古冰草遗传多样性研究结果表明，蒙古冰草种内居群间及同一居群内的不同个体间存在丰富的多样性；李景欣等＼[4＼]利用根尖压片法，从细胞水平对来自6个不同居群的冰草的遗传多样性进行研究发现，冰草种内居群间存在一定程度的分化和变异，一些北美国家有关冰草的研究，主要侧重其生态建设、耐牧性及营养物质的运输和储存等。近年来，ISSR分析技术在品种鉴定和种质资源的遗传多样性研究中得到广泛应用，有关冰草不同放牧强度下遗传多样性的研究报道较少，试验应用ISSR分析技术对不同放牧强度下的冰草遗传多样性及其分化进行研究，并为探索合理的放牧制度和草地利用方式，防止草原放牧和放牧草原的恢复提供理论基础，为筛选耐牧基因提供遗传学信息。 　　1材料和方法 　　在植物生长旺盛期按株采集冰草（Agroptron cristatum）新鲜叶片。株距50 m以上，选择株丛径中等、生长正常的植株30株，剪去叶片，用保鲜膜包好放入冰盒带回实验室，贮存于-20 ℃冰箱备用。 　　1.1试验地自然概况 　　试验地位于内蒙古自治区赤峰市克什克腾旗达里诺尔国家级自然保护区境内砧子山以东，N 116°381′～116°411′，E 43°251′～43°271′，气候属于中温型大陆性气候，年平均气温为1～2 ℃，≥10 ℃积温1 300～1 700 ℃，年降水量350～400 mm，无霜期为60～80 d，植物生长期4～9月，土壤类型为暗栗钙土。 　　草原群落随放牧强度的变化，在居民点或家畜饮水点周围相继分布的环状带上最明显，即由此向外辐射，沿半径方向构成草原群落的放牧梯度，因此，在试验区以居民点为一端，沿草原群落变化的方向设置样带。按照放牧草原分级方法，将草地划分为轻度放牧样地、中度放牧样地、重度放牧样地和无放牧样地（夏季无放牧的围封区）。 　　1.2DNA的提取与检测 　　称取0.25 g新鲜叶片。采用CTAB法提取每个植株的总DNA，用0.7%的琼脂糖电泳检测DNA质量， DNA的纯度和浓度通过紫外吸收法测定。 　　1.3ISSR反应条件及程序 　　PCR反应体系的建立主要通过对DNA浓度、引物等条件进行初步的调整，达到了反应条件的优化，确定了ISSR扩增反应总体积为25 μL，反应体系：其中，包括10×buffer 2.5 μL，2.0 mmol/L MgCl2 2 μL，0.1 mmol/L dNTPs 0.4 μL，0.15 mmol/L ISSR引物1 μL，40 ng基因组DNA，1单位TapDNA聚合酶。以上各种加完后用灭菌三蒸水补齐至25 μL。 　　扩增在PE9600型PCR仪上进行。扩增程序为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，进行44个循环，最后72 ℃补平5 min，4 ℃停止。扩增产物用2.8%琼脂糖凝胶（内含溴化乙锭）电泳鉴定，电泳1.5～2.0 h，将凝胶放在自动凝胶成像系统下进行分析。 　　1.4引物筛选 　　以无放牧样地的冰草DNA为材料，对30个ISSR引物进行筛选，筛选出12个扩增条带较多、信号强、背景清晰的引物用于ISSRPCR反应。引物由上海生物工程公司合成（表1）。 　　1.5扩增产物和差异带的分析方法 　　1.5.1带的记录 　　电泳图的每一条带（DNA片段），均为一个分子标记（Marker），代表一个引物的结合位点。根据各分子标记的迁移率及其有无统计所有的二元