第九章特异性抗体的制备技术.PPT

第五章抗 体 制 备 目 录 第一节 免疫原的制备 第二节 免疫血清的制备 第三节 抗体的纯化和鉴定 多克隆抗体（抗血清）制备的基本过程 抗原 半抗原+载体 佐剂 免疫动物（3-5次） 测效价 动物采血，分离血清 抗血清纯化、鉴定、保存 第一节 免疫原的制备 制备细菌抗原的程序 革兰阳性菌细胞壁的结构 革兰阴性菌细胞壁的结构 处理细菌： 1.加入石炭酸至终浓度为5%O抗原 2.选有动力的菌株，菌液用0.3%~0.5%甲醛处理H抗原 3.杀菌后在菌液中加入0.5%~1%氯化钙—Vi抗原 第二节 免疫血清的制备 快速免疫血清制备的免疫程序 第三节 抗体的纯化和鉴定 第四节 单克隆抗体技术 克隆是英文“clone”一词的音译，在台湾与港澳一般意译为复制或转殖，是利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因组之后代的过程.科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆，这门生物技术叫克隆技术，其本身的含义是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同 　　克隆通常是一种人工诱导的无性生殖方式或者自然的无性生殖方式（如植物）。一个克隆就是一个多细胞生物在遗传上与另外一种生物完全一样。克隆可以是自然克隆，例如由无性生殖或是由于偶然的原因产生两个遗传上完全一样的个体（就像同卵双生一样）。但是我们通常所说的克隆是指通过有意识的设计来产生的完全一样的 1996年7月5日克隆出一只基因结构与供体完全相同的小羊“多莉”（Dolly），世界舆论为之哗然。“多莉”的特别之处在于它的生命的诞生没有精子的参与。研究人员先将一个绵羊卵细胞中的遗传物质吸出去，使其变成空壳，然后从一只6岁的母羊身上取出一个乳腺细胞，将其中的遗传物质注入卵细胞空壳中。这样就得到了一个含有新的遗传物质但却没有受过精的卵细胞。这一经过改造的卵细胞分裂、增殖形成胚胎，再被植入另一只母羊子宫内，随着母羊的成功分娩，“多莉”来到了世界 蓝色 1．含量鉴定 在一定范围内，颜色深浅与蛋白质浓度呈直线相关。 方法：酚试剂法鉴定 主要试剂：磷钼酸-钨酸的混合酸 原理： 蛋白质中的酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸等能 钨酸、钼酸 还原 3H2OP205·13WO3·5MoO3·10H20 和3H2P205·14WO3·4MoO3·10H20 络合物的双缩脲法 蛋白质＋Ca2+ 碱性 加深 蓝色 已知分子量的标准品 测未知分子量：将样品在同一凝胶柱上，同一条 件下层析、洗脱、测保留体积，并查出分子量。 此法简便、样品用量少，有一定的实用价值。 凝胶柱 保留体积 分子量的对数 2.理化性质鉴定 绘制标准曲线 ①凝胶层析技术进行测定 垂直电泳 聚合成大分子凝胶 ②聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 有分子筛效应、电荷效应及浓缩效应，能精 确地分离和鉴定高分子物质。 PAGE的分子筛效应测定蛋白质抗原的分子量。 原理： 双丙烯酰胺 N,N-methylene bisacrylamide,Bis 丙烯酰胺 (acrylamide,Acr) 催化剂 3. 纯度鉴定 方法：醋酸纤维膜电泳进行鉴定。 原理：蛋白质在一定pH下都带有电荷，由于 各种蛋白质等电点不同、分子量也异，因此 所带电量也各不相同，在外加直流电场的作 用下，它们泳动的速度不同，经一段时间后 即可彼此分开，形成电泳谱；从而判断蛋白 质抗原的纯度。 特点：快速简便。 三、半抗原免疫原的制备 1.半抗原：低分子量的化学物质。例如多糖、 多肽、甾族激素、脂肪胺、类脂质、核苷、 某些药物(包括抗生素）及其他化学物品等。 2.载体：蛋白质类 多肽聚合物 大分子聚合物 3.半抗原-载体连接方法: 载体类型 1.蛋白质：人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔 血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白等。 2.多肽聚合物：人工合成的，常见的有多聚赖 氨酸，其分子量大（可达十几万到几十万)， 这种多聚物和半抗原结合