与大白菜干烧边性状相关SSR和SRAP标记分析.docVIP

与大白菜干烧边性状相关的SSR和SRAP标记分析 　　摘　要：以大白菜感干烧边品种A67和抗干烧边品种A53配制的141个F2代单株组成的群体为材料，双亲DNA构建大白菜感病池和抗病池，对104对SSR引物和320对SRAP引物进行筛选。并对与干烧边性状相关的OTL和对应的连锁关系进行了初步分析，获得2个与大白菜干烧边性状相关的OTL，同时获得3个与这2个OTL连锁的标记，其中A29―890和E6―400标记与其最近OTL位点的连锁距离分别为1.5cM和7.1cM。为大白菜抗干烧边性状的分子辅助育种奠定了基础。 　　关键词：大白菜；干烧边；SSR；SRAP；OTL 　　 　　大白菜(Brassica carapestris L，ssp，pekinensis)原产于我国，栽培历史悠久，资源丰富，类型多样。其种植面积和上市量均居蔬菜之首，是我国广大人民的“当家菜”。干烧边是一种生理病害，在大白菜结球期，由于气候干旱、土壤缺钙、盐分过高或施肥不当、浇水不匀等原因导致其经常出现，对大白菜产量和结球品质造成了极大影响。 　　干烧边性状在不同大白菜品种和材料上表现不同。有的品种在叶球外部没有表现，仅球内叶发病，导致后期腐烂：有的品种仅在球叶边缘表现，叶球内表现不严重，称为干烧边。许多品种因为干烧边，严重影响了市场地位，因此选育抗干烧边品种成为解决问题的关键。 　　目前关于大白菜抗干烧心的研究国内外主要集中在致病机理㈣、病症表现和室内鉴定方法等方面，分子方面的研究只有孙秀峰等利用AFLP技术进行了相关分析。本试验利用感干烧边病品种A67和抗干烧边病品种A53杂交获得的F2代群体作为材料，采用SSR和SRAP标记技术，开展了与大白菜干烧边性状相关的研究。该研究将对大白菜抗干烧边品种的选育奠定分子基础。 　　 　　1　材料与方法 　　 　　1.1　试验材料 　　以大白菜感干烧边病品种A67为母本，抗干烧边病品种A53为父本，进行杂交获得F1代，再将F1代自交获得了F2代群体。 　　 　　1.2　试验方法 　　1.2.1　材料栽培方法将双亲、F1代、F2代群体种子播种于育苗箱中，待其长出2片真叶时移植到8cm×8cm营养钵内，每钵栽培1株。以无钙蛭石为栽培基质，采用不含钙的改良Hoagland营养液配方进行无土栽培，即除去原配方中的Ca(N03)2?4H2O，使其他含N成分较原营养液增加约1倍，使总N量和原营养液基本持平：NH4NO3 2 mmol?L-1，KN0310mm01，L-1，NH4H2PO42 mmol?L-1，其他成分同Hoag-land营养液。移植50d后进行病级调查。 　　1.2.2　干烧边病情调查根据相关文献资料稍作修改后。将干烧边病情分为6个等级(表1)，对F2代群体的206个单株进行病级调查，用于统计分析。根据干烧心症状等级情况计算干烧心病情指数，根据下面所列抗性归类标准划分品种抗性等级。 　　 　　病情指数=［(各级发病株数×病级)／高发病级数×调查株树］×100 　　1.2.3　模板DNA提取从206株F2代群体中随机抽取141个单株，洗净、晾干后称取2.3～2.5 g的叶片。参照Clark的方法提取模板DNA。 　　1.2.4　引物筛选选取感干烧边品种A67和抗干烧边品种A53各8株，将2个亲本的DNA分别等量混合，构建感干烧边和抗干烧边DNA池。利用2个DNA池和它们的F1代后代作为模板，对104对SSR引物和320对SRAP引物进行筛选。获得具有多态性的引物，经过2次重复检验后用于对F2代群体的单株分析。 　　1.2.5　SSR和SRAP分析SSR引物序列包括23对锚定SSR引物和81对EST-SSR引物。其中锚定SSR引物参照国际上已发表的引物序列(表2)，EST-SSR引物是根据NCBI数据库中大白菜的相关EST序列设计。SRAP引物参照目前国际上已公开发表的序列，试验所用的引物序列见表3。 　　 　　 　　在20μLPCR反应体系中包含：10xTaq buffer 2μL,10 mmol.L-1dNTPs 1.6μ.10M上、下游引物各1μL，模板DNA 30ng，2.5UTaq酶0.2μL。 　　EST-SSR的扩增反应程序参考忻雅等方法：94℃预变性4min;94℃变性45s，复性1min，复性温度根据不同引物对由梯度PCR确定，72℃延伸1min 30s，进行35个循环；72℃延伸7min。4℃保温备用。SRAP反应程序参照雷剑和柳俊的复性变温法：94℃变性3min30s。前5个循环为94℃30s，35℃30s，72℃1min30s；随后，将复性温度提高到50℃45s。再进行35个循环，最后延伸10min.4℃保温备用。扩增反应在DNA engine