萤光分析法.DOC

水中葉綠素a 檢測方法－丙酮萃取／螢光分析法 NIEA E509.01C 一、方法概要 　　?? 水樣經玻璃纖維濾紙過濾後，濾紙以組織研磨器於90%丙酮溶液中研磨萃取葉綠素a，萃取液再以藍光光源的螢光儀測得螢光值，最後依製備之螢光值檢量線求得葉綠素a 濃度。 　　? 因使用之標準溶液葉綠素a 濃度，會受各種因子影響而衰減，每批次檢測時應以分光光度計再確認標準溶液之濃度。 二、適用範圍 　　? 本方法適用於地面水體、飲用水水源水質及海域地面水體之檢測。單一檢驗室之方法偵測極限估值為0.11 μg/L。 三、干擾 (一) 萃取後的萃取液與標準溶液易受溫度、光、酸及濁度所影響，應避免強光照射或接觸酸性物質。萃取液及標準溶液上機測試時，均須回溫至室溫。 (二) 萃取物如產生紅色光區的螢光，會干擾葉綠素a 的量測。 (三) 樣品中，其他種類葉綠素或胡蘿蔔素濃度過高會有螢光熄滅效應，可將萃取液稀釋以克服之。 四、設備及材料 (一) 量筒：100、500 mL或1 L之量筒。 (二) 玻璃纖維濾紙：直徑47 mm或25 mm，平均孔徑約0.7 μm（使用Whatman GF/F或同等級產品）。 (三) 過濾裝置：薄膜過濾裝置。 (四) 真空抽氣裝置：水壓式、吸氣式或手動式，壓力差低於0.2 kg/cm2（20 kPa）者。 (五) 鑷子。 (六) 鋁箔紙。 (七) 濾紙存放容器：能遮光，在運送過程及儲存時，可以存放含過濾樣本之濾紙，不受環境污染者。 (八) 運送儲存器：運送過程在4小時以內可使用如旅行冰桶，內放冰塊可維持在0～4℃；若超過4小時，需存放在低於-20℃的儲存器內，如液態氮桶、乾冰桶或冰箱之冷凍櫃。 (九) 冷凍櫃：可長期維持在-20℃以下。 (十) 組織研磨器：具組織研磨效果者。 (十一) 離心管：錐形底、15 mL，具螺紋蓋。 (十二) 離心機：懸臂式、可容納15 mL錐底離心管、離心力可達675 g以上（g為離心力，註1）。 (十三) 定量瓶：10、25、50或100 mL褐色定量瓶。 (十四) 移液管：0.5、1、2、3、4、5或10 mL A級玻璃移液管或同級品。 (十五) 恆溫水浴槽：循環式。 (十六) 分析天平：可精秤至0.1 mg。 (十七) 分光光度計：使用波長664.3及750 nm，狹縫寬度（band width）小於2.0 nm，吸光值靈敏度達0.001。 (十八) 螢光儀：使用激發光波長436 nm，放射光波長680 nm，光源為藍光者（Turner Designs Model 10 AU激發濾鏡436FS10及放射濾鏡680FS10或同等級產品）。 五、試劑 (一) 試劑水：電阻值須大於1 MW-cm，二氧化矽含量低於0.1 mg/L。 (二) 丙酮：層析級。 (三) 90%丙酮水溶液：混合100 mL試劑水與900 mL丙酮於儲存瓶中，混勻後標誌清楚。 (四) 葉綠素a 儲備溶液：在暗處，取不含葉綠素b之固體葉綠素a 標準品（註２），輕敲玻璃瓶身，使固體葉綠素集中在瓶底，再小心打開瓶子，使瓶中所有的固體物倒至50 mL量瓶中，以少量90%丙酮水溶液沖洗併入量瓶內，再以丙酮水溶液定容稀釋之，分裝至數個適當體積儲存瓶包覆鋁箔，保存於-20℃黑暗處，可保存6個月。使用時，取出一瓶回溫後進行配置標準容液。 (五) 葉綠素a 標準溶液：於100 mL定量瓶內，以90%丙酮水溶液稀釋1 mL葉綠素a 儲備溶液至刻度。每次檢量線製備前配製，並依步驟(一)執行濃度確認。 六、採樣及保存 (一) 視水中浮游藻類密度而定，採取代表性水樣約100 mL至4 L，記錄採樣體積、採樣時間及地點等。 (二) 採樣後將水樣混合均勻，量取適量水樣（視水樣而調整），立即以玻璃纖維濾紙進行過濾（壓力不得超過0.2 kg/cm2或20 kPa）。當水樣接近抽濾至乾時，關閉抽氣裝置避免過度抽乾，過濾時間不得超過10分鐘，過濾之水樣量以使濾紙呈微帶綠色或褐色者為佳。以鑷子移去濾紙，將含顆粒物面朝內摺，並用吸水紙將多餘水分吸乾，待進行萃取步驟。若無法立即萃取，應將濾紙置放於濾紙存放容器內包覆鋁箔避光，保存於-20℃冷凍櫃黑暗處。短暫4小時以內之運送可存放在冰桶（0～4℃）或液態氮桶中。 (三) 過濾的濾紙應保存於-20℃冷凍櫃中，期限不可超過一個月。 七、步驟 (一) 葉綠素a 標準溶液濃度確認 １、檢測每批次樣品應重新製作檢量線，製作檢量線前，需進行葉綠素a 標準溶液濃度確認。 ２、先以90%丙酮水溶液，分別對分光光度計在波長664.3與750 nm下歸零。 ３、在波長664.3與750 nm下測定葉綠素a 標準溶液之吸光值，分別得Abs664.3和A