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中药材景天三七DNA提取方法的比较分析 　　摘要：以景天三七药材为材料，分别采用改良CTAB法、SDS法、高盐低pH法对其DNA进行提取并检测，旨在建立一种适合中药材景天三七的DNA提取方法。结果表明，改良CTAB法提取的DNA浓度为290 μg/mL，电泳条带最亮，无拖尾现象，在浓度和纯度方面均优于其他2种方法，并可用于ISSR-CR扩增，改良CTAB法是中药材景天三七DNA提取的最佳方法。 　　关键词：中药材；景天三七；DNA提取；改良CTAB法；SDS法；高盐低pH法 　　中图分类号： S5672360文献标志码： A 　　文章编号：002-302（204）2-0047-03 　　目前，分子生物学技术在中药材研究中广泛应用，如药用植物的亲缘与进化关系、种质鉴定、分类和提取[-3]等，而DNA的分离纯化是中药材分子生物学研究的基础。但商品药材经过干燥、加工、贮藏等过程，DNA会出现不同程度的降解；同时，由于中药材中的小分子次生物质，如有机酸、萜类、香豆素、鞣质、黄酮等含酚羟基化合物，氧化后容易与DNA结合，[2]引起DNA降解，而其中存在的多糖由于与DNA同属于大分子化合物，在一般提取过程中很难完全去除，因此，针对不同药材进行DNA 提取方法的探索是有必要的。所以，本研究以市售景天三七（Sedum aizoon L）干品药材和新鲜嫩叶为材料，采用改良CTAB法、SDS法、高盐低pH法提取干品景天三七DNA，并对3种提取结果进行比较分析，选出适合中药材景天三七的简便、快速、高纯度的DNA提取方法，为中药材景天三七的遗传多样性、种质鉴定等分子水平的研究提供依据。 　　材料与方法 　　材料 　　中药材景天三七购自同仁堂药店，嫩叶取自运城学院栽种的中药材景天三七。 　　2试剂 　　CTAB、SDS、V、NaCl、Tris-HCl（pH值80）、EDTA、KAc、Tris饱和酚、β-巯基乙醇、异戊醇、异丙醇购自北京拜尔迪生物技术有限公司，RNase、rimer UBC89、 Taq聚合酶等试剂均购自上海生工生物工程技术有限公司。 　　3DNA提取方法 　　3改良CTAB法 　　材料加入液氮充分研磨后转入离心管，加入65 ℃预热的CTAB缓冲液，2 μL β-巯基乙醇，充分混匀；65 ℃温浴30～45 min，2 000 r/min 4 ℃离心0 min；上清液加入等体积酚 ∶[KG-3]三氯甲烷 ∶[KG-3]异戊醇（25 ∶[KG-3]24 ∶[KG-3]）充分混匀，2 000 r/min 4 ℃离心0 min；取上清液，重复以上步骤 ～2次，直到界面清晰为止；上清液加入等体积的三氯甲烷 ∶[KG-3]异戊醇（24 ∶[KG-3]）充分混匀，2 000 r/min 4 ℃离心0 min；上清液加入2～3倍体积的-20 ℃预冷无水乙醇，于-20 ℃静置30 min，沉淀用70%乙醇洗2次后加入50 μL TE溶解，加入RNase于37 ℃温浴 h，4 ℃保存。 　　32SDS法 　　材料加入液氮充分研磨后转入离心管，加入65 ℃预热的SDS缓冲液，2 μL β-疏基乙醇，充分混匀，65 ℃温浴30～45 min；取出冷却至室温后加入500 μL 5 mol/L KAc，充分混匀，冰浴20 min，2 000 r/min离心0 min；上清液加入等体积的三氯甲烷 ∶[KG-3]异戊醇（24 ∶[KG-3]），混匀，2 000 r/min 离心0 min；重复抽提次，上清液加入2/3体积的-20 ℃预冷的异丙醇，混匀，-20 ℃沉降30 min，2 000 r/min 离心0 min；上清液加入200 μL的70%乙醇和无水乙醇各洗涤沉淀2次，沉淀晾干后加入30 μL TE溶解，加入RNase于37 ℃水浴锅中恒温45 min，4 ℃保存备用。 　　33高盐低pH法 　　材料加入液氮充分研磨后转入离心管，加入56 ℃预热的2% SDS缓冲液，2 μL β-巯基乙醇，充分混匀，56 ℃温浴30 min，2 000 r/min 4 ℃离心0 min；上清液加入等体积的三氯甲烷：异戊醇（24 ∶[KG-3]），充分混匀，2 000 r/min 4 ℃离心0 min；上清液加入倍体积的异丙醇，2 000 r/min 离心5 min；沉淀的DNA用70%乙醇洗2次，晾干后加入50 μL TE，加入RNase于37 ℃温浴 h，4 ℃保存。 　　4DNA质量检验 　　4紫外检测 　　将所得 DNA提取液稀释00倍后，用UV02紫外分光光度计分别测定230 nm、260 nm及280 nm处的吸光度。根据D260 nm/D280 nm值判断DNA纯度，以D260 nm的值计算DNA浓度。 　　42琼脂糖凝胶