试验一质粒DNA的提取-西安医学院基础医学试验教学中心.PPT

西安医学院生化教研室 质粒DNA的提取 了解碱法提取质粒的原理； 掌握碱法提取质粒的方法。 实验目的 特点： 超螺旋共价闭环结构,小的2-3kb，大的可达数百kb 可插入外源DNA片段，≤15kb 含有标记基因，可使宿主菌获得某些性状，如：amp抗性，tet抗性。 分为紧密型和松弛型质粒 质粒：存在于细菌染色体之外的、具有自我复制 能力的环状双链DNA分子。 plasmid map Experiment Material 碱裂解法抽提质粒DNA的原理： ——染色体DNA与质粒DNA变性与复性的差异 质粒DNA的提取 条件 染色体DNA 质粒DNA pH=12.6 变性 不完全变性 pH=中性 不能复性 复性 离心 沉淀 （染色体DNA+RNA+蛋白-SDS复合物） 存在于上清中 在碱性条件（pH 12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。 这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。 质粒的超螺旋结构 培养细菌，收集与裂解细菌，质粒DNA的分离 除去细菌染色体DNA、RNA和