人乳铁蛋白沙漠小球藻表达系统构建与鉴定.docVIP

人乳铁蛋白的沙漠小球藻表达系统的构建与鉴定 　　摘要：为获得人乳铁蛋白的沙漠小球藻（Chlorella sp. GTD8A1）的表达系统和稳定的小球藻GTD8A1-hLF工程藻种，将人乳铁蛋白基因导入小球藻细胞中进行表达鉴定。以人血cDNA为模板，RT-PCR扩增得到人乳铁蛋白基因（GenBank登录号NM-002343.4），经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后，连接到植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS中，获得重组质粒载体pCAMBIA2300-35S-hLF-OCS，将重组质粒电击转入GTD8A1中，通过菌落PCR鉴定后扩大培养，在DNA和RNA水平分析人乳铁蛋白基因的整合和转录，SDS和Western Blot分析获得70 ku的目的蛋白；将转基因藻种（GTD8A1-hLF）在BBM培养基中进行培养周期优化。结果表明，重组人乳铁蛋白在沙漠小球藻细胞中表达成功；通过Elisa测其人乳铁蛋白表达量在20 d时达到最大，浓度为13.28 mg/L。 　　关键词：小球藻；人乳铁蛋白；表达系统；SDS；Western Blot；构建；鉴定 　　中图分类号： S188 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）19-0138-05 　　收稿日期：2016-05-06 　　基金项目：国家自然科学基金（编号。 　　作者简介：牟 云（1992―），女，四川华蓥人，硕士研究生，从事可再生能源的开发与利用相关研究。E-mail：1171534413@。 　　通信作者：高剑峰，教授。E-mail：jianfengg@。 新疆古尔班通古特沙漠位于准噶尔盆地的中央，是我国第二大沙漠和面积最大的固定、半固定沙漠。年降水量70～150 mm，冬季有积雪，春季和初夏降水略多，冬季最低地表温度可达-25 ℃，夏季最高地表温度可达30 ℃[1]。生长在此的小球藻及其他藻类与高等植物经过百万年的进化，已经完全适应了沙漠的极端环境。从20世纪80年代末开始，对沙漠微藻的研究与开发受到国内外研究者的重视[2]。研究表明，在新疆沙漠中生长着百余种藻类，小球藻是其中重要的组成部分[3]。小球藻为球形或椭圆形绿色单细胞藻类植物，也是真核微生物的一种。其细胞直径3～8 μm，是地球上最早的生命之一，出现在20多亿年前，遗传相对保守，其广泛分布于土壤、湖泊、海洋、南北极生态系统和荒漠，是生物量丰富、生产力较高的单细胞生物[4]。作为广泛分布的单细胞藻类植物，小球藻是在单细胞水平上研究和建立转基因表达系统及其相关条件优化和其他具有药用价值的副产品开发和研究的绝佳材料。目前，由于四代生物燃料崛起，国内外关于小球藻基因组学、基因工程[5]的研究与开发日趋活跃。近几年，随着小球藻基因组测序[6]的完成，以及对其外源蛋白基因排斥与免疫[7-8]的深入研究，使得小球藻这种单细胞微生物成为最佳生物反应器的研究焦点，也是研究外源基因表达的最佳材料。 　　乳铁蛋白（lactoferrin，LF）是乳汁中一种重要的非血红素铁结合糖蛋白，是一种糖基化蛋白，分子量为70～80 ku、约700个氨基酸，基因的大小在2 112～2 530 bp之间；广泛分布在初乳、牛奶及其相应的分泌物如眼泪、唾液中，是一种多功能性糖蛋白，在各种动物之间的同源性较高[9]。它能螯合生物体液中的铁（Fe2+或Fe3+）或者破坏微生物的细胞膜，使其减少微生物（细菌、病毒和寄生虫）的增殖、黏附或者将其杀死，从而表现出抗菌的作用[10]。人乳铁蛋白（human lactoferrin，hLF）是一条多肽链折叠形成2个对称的环状结构（N and C lobes），包含部分α-螺旋?接域[11]。人乳铁蛋白对免疫、细菌、病毒、微生物、抗寄生虫和真菌都有相应的保护和抗性的作用，从而被开发成食品添加剂和保健品等。同时，科学界也将乳铁蛋白列为新型抗生素的候选者[12]。目前，人乳铁蛋白也被加工成婴幼儿奶粉的食品添加剂，受到广大消费者的青睐。但是，人乳铁蛋白主要由初乳和血液来提取获得，这就使得人乳铁蛋白的产量少之又少，价格昂贵。因此，有科学家提出采用分子的手段去开发不同种类的乳铁蛋白的重组体，以增加乳铁蛋白开发和利用价值。 　　本试验结合小球藻的优势和人乳铁蛋白的优点，首次以真核为宿主，在沙漠小球藻GTD8A1基因组上整合外源人乳铁蛋白基因（hLF），利用小球藻细胞作为生物反应器及其生长周期短、传代快速、代谢可控的优点，获得稳定表达人乳铁蛋白小球藻菌株，进而为小球藻生产人乳铁蛋白下游工业提供优良的藻种。这将为人乳铁蛋白的下游工业、商业化和推广使用提供试验基础和技术支持。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 植物材料 小球藻GTD8A1由笔者所在实验室分