人类羊膜对兔皮组织缺损修复影响探究.docVIP

人类羊膜(HAM)融合移植骨髓间质干细胞(MSC)对兔皮组织缺损修复的影响探究 　　[摘要] 本文旨在研究在将间质干细胞(MSC)移植于人类羊膜(HAM)后,注入损伤兔体全皮的条件下兔体全皮损伤的修复效果。4组兔体的全皮有大致相同的五个缺损伤口,它们分别被不同的药剂处理,其中:A组被融合自体同源MSC的HAM所处理;B组被融合异体同种MSC的HAM所处理;C组被HAM所处理,同时注射自体同源的MSC;D组被HAM所处理,同时注射异体同种的MSC。 　　在药剂注入的7、12及15天后,每个兔体小组内兔皮伤口的大小均有所测量及记录。一般情况下,药剂注入25天后几个小组兔皮伤口均陆续愈合。用苏木精与曙红对创口染色并在显微镜下观察,染色区可观察到表皮与真皮层颗粒状组织数量及其他特征。 　　其中,A、B两组在药剂注入术后的7、12、15天后伤口愈合相关数据方面进展明显,在皮肤伤口修复方面表现出最为显著的效果。且A、B两组数据没有统计学上显著的差异。 　　对A、B两组进行组织学水平检查,发现成熟分化的薄层表皮,以及附着沉积胶原蛋白束的真皮层皮肤组织附件,附件完全恢复;C、D两组为不成熟分泌薄壁细胞的致密表皮,真皮层皮肤成纤维细胞不断增殖,附件不完全恢复。因此,填充MSC的HAM的注入对于兔皮组织缺损修复起着重要作用,而自体同源MSC与异体同种MSC的植入对于伤口的愈合情况没有显著的效果差异。 　　[关键词]羊膜组织 间质干细胞 组织工程移植皮肤组织缺损修复 　　 　　简介 　　本实验选用骨髓干细胞与羊膜组织融合体修复缺损的皮肤组织,探讨的主要问题是:一、人类羊膜(HAM)与骨髓干细胞(MSC)融合后注入的修复效果与HAM、MSC分别注入的修复效果比较;二、异体同种干细胞与自体同源干细胞在修复过程中的效果比较。 　　在最近的研究中,异体同种间质干细胞(MSC)被证明在促进伤口愈合方面作用显著,无论是单独注入皮肤伤口处还是与人类羊膜(HAM)融合后注入伤口处。本研究旨在调查将MSC与HAM融合后植入兔全皮损伤处对伤口愈合的影响。 　　一、实验材料与具体方法 　　1.取材动物:健康白兔。数量:21只;年龄:15周左右;体重:2-2.5千克。 　　2.分配方式:其中一只用于异体同种干细胞的取材;另外20只被随机平均分配到A、B、C、D四组中。每组白兔均在相同环境中喂养,食物与水的份量均按标准给予。 　　3.人类羊膜(HAM)的准备:提取胎盘材料,在含抗生素的无菌环溶液中浸泡清除血渍。将羊膜小心剥离,用无菌环溶液漂洗,上皮朝上放置于硝化纤维纸上于-80℃环境中保存。使用前取出,于37℃环境中放置30分钟,剥离硝化纤维膜,上皮朝上置于载玻片。将羊膜于37℃0.25%胰岛素-乙二胺四乙酸中浸泡30分钟后用磷酸缓冲盐溶液冲洗。 　　4.间质干细胞(MSC)的隔离培养:自体同源间质干细胞通过穿刺实验组中白兔股骨末端而取得;异体同种间质干细胞则取自未被分进组内的白兔,无菌条件下取得。提取骨髓2ml,置于含肝磷脂的无菌试管内。于萃取液中分层筛选出红血球,将浮于表层的血浆倒掉。将骨髓样品倒入1.077g/ml Ficoll-Hypaque溶液中,在室温下以1000r/min的速度离心20分钟。随后可用10%胎儿血清和抗生素(100IU/ml青霉素,100μg/ml链霉素)在底部溶液中央及溶液界面处提取干细胞,并以106个/ml的细胞密度将其转移到组织培养瓶内。培养瓶置于培养箱内,周围气体环境潮湿(5%CO2,95%空气,37℃)。48小时后第一次换气,之后每2-3天换一次。原始培养大约持续7-10天,在此期间,非粘附性的造血细胞碎片被遗弃。培养细胞分裂一定次数后注入0.25%胰岛素溶液与0.02%乙二胺四乙酸溶液使之传代2-3次。 　　5.间质干细胞(MSC)在人类羊膜(HAM)表面的转染与填充:转染细胞在使用前于37℃,5%CO2环境下在全能补给性培养基上放置4小时。随后用CD45,73,105, 166流式细胞计测间质干细胞的显型与纯度。将细胞活素基因(干细胞因子)转染至曾活体传代的间质干细胞中,并对细胞标记上绿色荧光蛋白质后融合进羊膜,荧光镜检确保转染成功。流式细胞计分析结果表明传代间质干细胞的纯度约为85%-97%。 　　在羊膜组织表面用播种环划下填充间质干细胞(MSC)的范围。转染前3小时抽离MSC介质并置换新鲜培养基。使用磷酸钙对细胞进行转染。在无菌试管内加入DNA、氯化钙以及足量的蒸馏水,另一试管内加入额定数量的缓冲盐溶液。将无菌试管内溶液倒入缓冲液,一边倒入一边摇匀,倒毕后于室温放置30分钟后继续摇匀。最后,将溶液倒至HAM所在的培养皿上,轻轻摇晃使之在HAM表面分布均衡。随后立即用冷冻纤维蛋白黏合剂将间质干细胞