弓1虫RH株SAG1基因序列体外扩增及生物信息学分析.docVIP

弓1虫RH株SAG1基因序列体外扩增及生物信息学分析 　　摘 要：根据SAG1基因序列，自行设计一对寡核苷酸引物。利用PCR技术从弓形虫RH株基因组DNA中成功扩增出编码SAG1抗原的基因片段，扩增出的基因片段大小与预期长度(1006bp)相符，结果经测序验证，并利用生物信息学方法对SAG1蛋白理化性质、结构和功能进行了预测。 　　关键词：弓形虫；SAC1基因；体外扩增；生物信息学分析 　　中图分类号：R382.5　文献标识码：A　文章编号：1007-7847(2007)04-0348-04 　　 　　弓形虫(Toxop1asma gondii)是一种专性细胞内寄生原虫，可感染包括人类在内的所有哺乳动物的有核细胞，正常人感染弓形虫后，多呈无症状带虫免疫状态，但孕妇感染后，则可致流产、死胎以及胎儿先天畸形，弓形虫作为一种重要的机会性致病原虫，已成为导致免疫缺陷患者死亡的主要原因之一，sAC1是刚地弓形虫速殖子主要表面抗原之一，其分子质量约为30kD，研究表明3AC1在弓形虫入侵宿主的过程中发挥了双重作用，它不仅在介导弓形虫速殖子入侵宿主细胞的过程中发挥了重要作用，而且还可引发宿主体内强烈的抗原抗体反应，此种免疫原性特质，使其成为诊断性抗原与免疫性抗原的重要候选基因，本文根据RH株54C1基因序列参考相关文献设计并合成了一对寡核苷酸引物，采用PCR技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码SAC1基因片段，并对其进行序列测定及生物信息学分析，为进一步通过基因工程进行表达做准备，同时也为体外研究弓形虫SAC1基因的结构与功能及其在免疫诊断学中的应用打下了基础。 　　 　　1 材料和方法 　　 　　1．1　材料 　　1．1．1　主要试剂及工具酶 　　TaqDNA聚合酶(Takara公司)；dNTPs、蛋白酶K(上海生物工程公司)；Tris碱、SDS、EDTA、酚、氯仿均为国产分析纯。 　　1．1．2　虫株 　　弓形虫RH株由中山大学医学院陈观今教授惠赠。 　　1．1．3　实验动物 　　SPF级昆明小鼠，6～8周龄，18～20g，购于广东医学实验动物中心。 　　 　　1．2　方法 　　1．2．1　引物的设计与合成 　　根据GenBank中弓形虫54C1基因序列(序列号：S76248)311～1321位，设计一对引物P1和P2，P1：5-ATGTCGGTTTCGCTGCACCACTT-3，，P2:5-TACGCGACACAAGCTGCGATAGAGCC-3，引物由上海生工合成，并经PAGE纯化。 　　1．2．2　弓形虫基因组DNA提取 　　弓形虫RH株速殖子复苏后，每只0.3m1腹腔接种感染昆明小鼠，3～5d后，脱颈处死小鼠，腹腔注入2m1　PBS，收集腹水，PBS洗涤两次，离心收集虫体，加100mmo1/1Tris-C1，5 mmo1/1EDTA，200 mmo1/1 NaC1，1％SDS，100mg/1蛋白酶K，55℃震荡过夜，然后分别用饱和酚、氯仿／异戊醇各抽提一次，等体积异丙醇沉淀，沉淀溶于100μ1三蒸水中，-20℃保存备用。 　　1．2．3　目的基因片段的PCR扩增 　　在0.2m1 Eppendoff管中依次加入下列成份：ddH2O 36.75μ1 10x缓冲液5μ1、dNTP(10mmo1/1)1μ1、正反向引物(20μmo1/1)各1μ1、模版DNA 5μ1，Taq酶0.25μ1，总反应体积为50μ1.95℃预热10min后，94℃60s，50℃60s，72℃ 120s，行30个循环，将PCR产物5tx1在含溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶中电泳，UVP观察结果并拍照。 　　1．2．4　DNA序列测定 　　PCR产物由上海英骏生物技术公司进行序列测定。并与GenBank中的基因序列(S76248)进行同源性比对。 　　1．2．5　克隆序列的生物信息学分析方法 　　利用ExPASy中的Trans1ate程序将jAC1基因的核苷酸序列翻译成蛋白质氨基酸序列，通过protparam(http://us.省略/egi-bin/protparam)分析SAG1蛋白的物化参数，采用NCBI服务器中的CDD程序对氨基酸序列进行保守功能域分析，判断该基因是否具有完整的保守结构域，进一步推断对应的核苷酸序列是否具有完整的开放读码框，采用InterPro程序(http://www.ebi.ac.uk/InterProSean)对SWISS-PROT数据库进行检索，寻找氨基酸序列的功能结构域，了解目的序列可能的功能性质，利用NPS及Singa1 IP3.0及PSORT服务器，对蛋白质的二级结构及折叠类型、信号肽位置、亚细胞定位及跨膜螺旋域进行预测，进一步了解目的序列的基本特征。 　　 　　2