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外源基因导入真核细胞技术 外源基因在真核细胞内表达的意义  真核细胞提供重组的哺乳动物基因一个仿真的环  利于真核细胞内表达产物的生理作用研究  源于真核细胞的基因只有在真核细胞中的表达产物才 有特定的生理活性  真核细胞基因生理功能研究与基因改造和基因治疗  纯化大量重组的生物药品  随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染 已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常用手段之 一。如表达纯化特定蛋白；鉴定基因的生物学特性； 突变分析；信号通路研究等。影响转染效率的因素有 很多，细胞株本身的特性和活性、细胞培养条件、转 染的DNA或RNA的质量、转染方法、转染试剂的选 择等。  瞬时转染是指外源基因进入受体细胞后，存在于游离 的载体上，不整合到细胞的染色体上，在外源基因导 入细胞1~4天后收获细胞进行分析。  稳定转染需要外源基因整合到细胞的染色体上，从而 得到稳定的转染细胞株。 第一节 磷酸钙沉淀法  磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将 DNA导入真核细胞的转染方法，磷酸钙被认为有利 于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。磷酸钙- DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细 胞，被转染的DNA可以整合到靶细胞的染色体中从 而产生有不同基因型和表型的稳定克隆。这种方法 首先由Graham和van der Ebb使用，后由Wigler修改 而成。可广泛用于转染许多不同类型的细胞，不但 适用于短暂表达，也可生成稳定的转化产物。  质粒DNA在含有CaCl 和磷酸盐缓冲液的环境中，在细胞 2 表面形成DNA-磷酸钙沉淀物，进而被细胞摄入。因此， 此法较适于贴壁生长的细胞。转化效率一般在10%左右， 但受细胞类型的影响较大。甘油和二甲亚砜通过休克效 应，可提高细胞的转化率。  沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。 在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量， 因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转 染的失败。  磷酸钙沉淀法这是利用pH 7.01磷酸钙形成细颗粒，DNA 吸附于颗粒而被导入细胞。其优点是方法简便、易于重 复。缺点是转移导入的效率低，均在10-6-10-7之间。  主要应用：稳定转染，瞬时转染。  特点：不适用于原代细胞（所需的DNA浓度 较高），操作简便但重复性差，有些细胞不 适用。 建议用CsCl梯度离心，转染时拷贝数较多。  仪器、材料和试剂 1. 呈指数生长的真核细胞（如:HeLa，BALB/c 3T3，NIH 3T3，CHO， 或鼠胚胎成纤维细胞）。 2. 完全培养液（依所用的细胞系而定）。 3. CsCl纯化的质粒DNA （10～50 µg/次转染，二次纯化 4. 2 ×HEPES缓冲盐水(HeBS 。 5. 50.0 mM HEPEs；280 mM NaCl；10 mM KCl；1.5 mM葡萄糖。 用0.5 mM NaOH调pH至6.95～7.05，过滤除菌后，-20℃保存备用。 6. 2.5 M CaCl 过滤除菌，-20℃保存备用。 2 7. 0.15 M磷酸缓冲盐水（PBS）。 8. 37℃，5% CO 的加湿培养箱。 2 9. 100 mm组织培养平板。 10. 15 ml锥形管。  方法与步骤 1. 传代细胞准备：细胞在转染前24 ｈ传代，待细胞密度达 50%～60%满底时即可进行转染。加入沉淀前3～4 h ，用9 ml 完全培养液培养细胞。 2. DNA沉淀液的准备：首先将质粒DNA用乙醇沉淀（10～50 µg/10 cm平板），空气中晾干沉淀，将DNA沉淀重悬于450 µl无菌水中，加50 µl 2.5 M CaCl 。 2 3. 用吸管在500 µl 2 ×HeBS 中逐滴加入DNA-CaCl 溶液，同时 2 用另一吸管吹打溶液，直至DNA-CaCl 溶液滴完