拟南芥芥子酶基因TGG6是花特异表达的假基因.docVIP

拟南芥芥子酶基因TGG6是花特异表达的假基因 　　摘 要：芥子酶是一类催化硫代葡萄糖苷水解的同工酶，TGG6是在拟南芥中新发现的芥子酶基因，从拟南芥几个不同生态型中克隆了TGG6基因的全长核基因和cDNA片段，序列分析结果表明，所有供试的生态型的TGG6基因都与拟南芥第3个芥子酶基因TcC3类似，在编码区存在1个以上移码突变，不能编码完整多肽。生态型Col-O第10个?含子的剪切边界还发生了缺失，导致内含子不能被切除，初步确定TGG6是一个假基因，然而，RT-PCR结果却表明TGG6在花器中特异性表达，说明TGG6在进化的某个阶段可能是有功能的基因，由于某种原因，该基因在进化过程中被失活。 　　关键词：拟南芥：芥子酶；TGG6；组织特异表达；花特异表达；假基因 　　中图分类号：Q78　文献标识码：A　文章编号：1007-7847(2007)04-0316-07 　　 　　随着更多物种基因组测序计划的展开或完成，人们对假基因的概念及其意义有了更新的思考，并成为基因组学研究的一个热点，假基因(pseUdogene)被定义为核苷酸序列与相应正常功能基因相似的，但不能合成功能蛋白质的失活基因，假基因最初由jacq等人提出。他们在非洲爪蟾DNA中克隆了一个5S rRNA相关基因，在与其相应功能基因比较后发现，这个基因的5′端有16bp的缺失以及14bp的错配，不具有正常5S rRNA的功能，因此，将这个截短的5SrRNA的相关基因描述为假基因，随着人类基因组计划的完成和后基因组计划的实施，对占人类基因组约90％的非编码序列的研究已经展开，预计人类基因组中有约20000种假基因，在线虫、果蝇以及酵母等生物中也发现大量假基因，假基因保留了祖先功能基因的残余拷贝，为研究生物进化和基因组动态变化，分析基因复制与突变等事件的年代以及频率，揭示基因组DNA替换、插入和缺失等事件的机制提供了重要线索，此外测定假基因的分布可为新基因的预测以及鉴定提供更好的帮助。 　　芥子酶(myrosinase，EC3.2.1.147)是一类硫代葡糖苷酶，主要分布在白花菜目植物中，专一降解硫代葡糖苷，芥子酶和硫代葡糖苷分别储藏在不同的细胞中，当植物受到昆虫或病源伤害时，芥子酶将硫代葡萄糖苷水解为异硫氰化合物、硫氰化合物、腈或(口恶)唑烷硫酮等有毒物质，抵御病虫侵袭，因此认为“芥子酶／硫代葡萄糖苷”系统是植物重要的防御系统，目前已在15个科500多种双子叶植物中检测到芥子酶活性，其中，对十字花科作物的芥子酶研究得较多，油菜和白芥等作物的芥子酶基因家族由MA、MB、MC 3个亚家族组成，共20多个基因，其中部分基因已被证实为假基因”。 　　在拟南芥中，最初认为只有3个芥子酶基因，其中第3个基因TGG3被证实为花特异表达的假基因，由于3个基因都不在根中表达，人们却检测到根提取物的芥子酶活性，因此推测存在更多的芥子酶基因，2001年Nitz等分离到一个根特异表达的葡萄糖苷酶基因Pyk10，由于与芥子酶基因相似性高，认为是芥子酶基因，但是由于没有酶活性测定证据，而且Pyk10不具备芥子酶关键特征位点，因此Pyk10不一定是芥子酶基因，通过Blast分析，我们发现了3个序列高度相似的基因具有芥子酶基因的特征，分别命名为TGG4、TGG5、TGG6，其中TGG4、TGG5在根部特异表达，酵母表达产物具有芥子酶活性，证明是芥子酶基因(待发表)，TGG6在DNA序列上与TGG4和TGG5高度相似，但是在根部检测不到表达。使用TGG4和TGG5的cDNA序列与GenBank中的TGG6基因组DNA序列比对，个别内含子的剪切边界很难确定，因此难以断定TGG6是否是有功能的基因，本研究同时从拟南芥几个生态型克隆了TGG6的核基因和cDNA，通过生物信息学分析，发现TGG6存在移码突变和内含子剪切边界的突变，不能合成有功能的芥子酶，具有假基因的特征，因此推测TGG6是一个假基因。 　　 　　1　材料与方法 　　 　　1．1　拟南芥生态型和种植方法 　　本实验所使用的生态型Col-O、Ba-O、Ws-O来自Nottingham Arabidopsis Stock Center，England，JM1、JM2由作者实验室收集保存，种子播种在标准营养土上，4℃放置3d后转到培养室培养，培养室温度20℃，光照16h/d，光照强度5000lx， 　　 　　1．2　总DNA的提取和，GG6基因的克隆 　　取拟南芥5种生态型植株的叶片，液氮研磨，采用大连宝生物公司总DNA提取试剂盒提取总DNA，以基因特异引物G6F1(5′-ACCCGCTGAAAAGCTCCATCAA-3′)，G6R1(5′-GGCTYCCACTYATITYGCAATGAACC-3′)扩增TGG6基因组DNA