BL21DE3感受态细胞说明书.docVIP

杭州新景生物试剂开发有限公司区 地址：浙江省杭州市西湖科技经济园金蓬街366号1号楼东4F 邮编：310030 电话：0571 传真：0571 HYPERLINK 仅供科研使用，请勿用于人体及动物的治疗或临床诊断。 Ver.1 BL21（DE3） 感受态细胞说明书 产品组成 BL21（DE3）感受态细胞 Cat.No. 10支 8304010 20支 8304020 BL21（DE3）感受态细胞 100μl ×10支 100μl ×20支 Control DNA（pUC19，0.1ng/μl） 10 μl×1支 20 μl×1支 说明书 1份 1份 产品储存 感受态细胞必须用干冰运输，融化后的感受态细胞不能再冻结储存。如果用户收到感受态细胞后发现泡沫箱中的干冰已经挥发殆尽，应予以拒收。 收到感受态细胞后应立即储存在-70℃以下的冰箱中，在6个月内使用不影响转化效率；感受态细胞不可反复冻融，不要与限制性内切酶等经常使用的分子生物学试剂放在一起，避免因温度的波动而影响的效率。 技术支持 杭州新景生物试剂开发有限公司研发部：E-mail:technical@，电话：400-0099-857。 产品介绍 本公司生产的BL21（DE3）感受态细胞是采用大肠杆菌BL21（DE3）菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用DNA的化学转化。经pUC19质粒检测，转化效率可达107cfu/μg。?每支感受态可以酌情分装使用，降低了实验的成本。 BL21（DE3）菌株介绍 基因型： F-，ompT， hsdS（rBB-mB－），gal， dcm（DE3）。 特 点：本菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 质量标准? ?1.?使用1?ng?pUC19?Plasmid质粒DNA转化100?μl?Competent?Cells?DH5α测试，产生的菌落数?＞1×107?transformants/1μg?pUC19?Plasmid?。????????????? ?2.?100?μl的E.coli?Competent?Cells?BL21（DE3）在含有?100?μg/ml?Ampicillin的L-琼脂平板培养基上过夜培养40?hr不产生菌落。 用户需自备的试剂与物品 试剂：LB液体与固体培养基、抗生素。 物品：弯头玻棒铺菌器、碎冰、水浴锅、超净工作台、摇床、移液器与无菌吸头、无菌1.5ml离心管、台式小量离心机（可配1.5ml离心管和2ml离心管的转子）。 使用前准备 1. 感受态细胞从-80℃取出立即置于冰上冻融，将水浴锅温度设置为42℃或将相应抗生素平板温育至37℃。 2. 相应抗生素溶液。 常规操作步骤1. 从-70℃冰箱中取出感受态细胞置于冰上融化，如需分装可将刚融化的细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中，再置于冰浴中。 * 一次转化感受态细胞的建议用量为50-100 μl，可以根据实际情况分装使用。应注意所用DNA体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。 * ?以下实验以100?μl感受态细胞为例。 向感受态细胞悬液中加入目的DNA（1-10 ng，且体积10 μl），轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰浴30分钟。 * 转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA量过多或体积过大时反而会降低转化效率。转化时DNA体积要小于感受态细胞体积的十分之一。? 3. 将离心管置于42℃水浴中90秒，迅速将管转移到冰上3分钟。 * 注意该过程不要摇动离心管。 4. 向离心管中加入900 μl 无菌LB 培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃摇床振荡培养1 小时（160-220 转/分钟）。 * 该步骤的目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。 将已转化的感受态细胞低速离心（5000 rpm, 4分钟）后弃掉部分上清，保留100-150μl培养基，用移液器轻轻吹打悬浮菌体后，全部加到含相应抗生素的LB 固体琼脂培养基上，用无菌弯头玻棒铺菌器将细胞均匀涂开。 * 如果预计的单克隆数量较多，可省略离心步骤，直接取200-300μl转化产物涂布平板（过多的菌液涂布可能会使单克隆菌落粘连在一起，难以挑取）。涂布后剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的菌液再涂布至新的平板上。