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冷冻保存对猪精子DNA完整性及形态结构影响 　　摘要：采集姜曲海猪精液，对其进行超低温冷冻保存，解冻后分别通过显微镜、扫描电镜和吖啶橙染色观察其形态、超微结构和DNA完整性，探讨冷冻保存对猪精子DNA完整性及形态结构的影响，同时探讨海藻糖和乳糖对冷冻精子的保护作用。结果表明，冷冻后精子形态正常率（海藻糖组和乳糖组分别为74.7%、67.6%）及DNA完整率（海藻糖组和乳糖组分别为66.4%和63.2%）均显著低于新鲜精子（95.5%和94.7%），且冷冻组间也存在显著差异（P0.05）；冷冻造成精子结构不同程度的损伤，主要表现为精子头颈部发生部分或全部断裂，颈部肿胀，顶体结构损伤。 　　关键词：猪精子；冷冻保存；DNA；形态结构 　　中图分类号：S828.3+4文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）01-0151-02 　　收稿日期：2013-05-20 　　项目基金：江苏省自然科学基金（编号：BK2008589）；江苏省“青蓝工程”项目[编号：苏教师2010（27）号]；江苏省无锡市农业产学研合作项目。 　　作者简介：羊建平（1965―），男，江苏泰兴人，硕士，副教授，主要从事动物医学教学及科研工作。E-mail：jstzyip@。精子的长期保存在畜牧业、低温生物学种质资源保存及动物基因研究等方面具有重要的意义；但冷冻保存猪精液应用于人工授精的比例尚不足1%，仍存在冷冻-解冻后活力差、受胎率低、产仔数少等诸多问题[1-2]。许多学者致力于猪冷冻精液的研究，但关于精子冷冻后DNA损伤及超微结构研究较为缺乏。因此，本试验探索冷冻保存对猪精子DNA完整性及超微结构的影响。 　　1材料与方法 　　1.1精液采集 　　4只成年、健康、性欲旺盛的姜曲海种公猪由国家级姜曲海种猪场提供。利用手握法采集精液，立即置于保温桶中，1 h 内带回实验室。将精液用专用滤纸过滤至37 ℃预热烧杯中，然后按照1 ∶1.5与稀释液（德国米尼图MII稀释剂）进行稀释。 　　1.2稀释液和冷冻液的配置 　　1.2.1冷冻基础液的配置分别称取葡萄糖1.1 g，Tris 2.42 g，柠檬酸钠1.48 g，青霉素0.06 g和链霉素0.1 g，溶解于双蒸水中，定容至100 mL。 　　1.2.2冷冻液的配置冷冻I液：海藻糖组（冷冻1组），在稀释液的基础上添加375 mmol/L 海藻糖、0.1%十二烷基磺酸钠（SDS）、0.05 %维生素C和20%卵黄；乳糖组（冷冻2组），在稀释液的基础上添加375 mmol/L 乳糖、0.1%十二烷基磺酸钠（SDS）、0.05 %维生素C和20%卵黄。冷冻Ⅱ液：在冷冻I液的基础上添加甘油，使其终浓度为3%。 　　1.2.3吖啶橙染色液的配置吖啶橙溶液：吖啶橙0.1 g溶解于100 mL蒸馏水中；枸橼酸溶液：枸橼酸1.91 g溶解于100 mL蒸馏水中；磷酸氢二钠溶液：Na2HPO4?12H2O 10.74 g于100 mL蒸馏水中。临用时，分别取吖啶橙染色液10 mL、枸橼酸溶液40 mL、磷酸氢二钠溶液7.5 mL混合，即为吖啶橙染色液。 　　1.3精液冷冻-解冻方法 　　将1 ∶1.5稀释后的精液置于17 ℃过夜，17 ℃离心（800 g，12 min），弃上清，然后加入冷冻I液于4 ℃平衡 1.5 h；再加入等体积4 ℃预冷的冷冻Ⅱ液，使精液最终稀释比为 1 ∶2，然后再于4 ℃平衡、分装于0.25 mL细管中，不超过 45 min，距液氮面3 cm熏蒸10 min，然后投入液氮保存 7 d。 　　解冻时，将细管从液氮中迅速取出，直接投入37 ℃水浴中并迅速摇晃。将解冻后的精液收集于10 mL试管内，然后用9倍体积的PBS液清洗精子。 　　1.4精子正常形态率的检测 　　于相差显微镜下直接观察活精子的正常形态率，至少计数200个精子。将巨型精子，短小精子，双头或双尾精子，顶体膨胀或脱落精子，精子头部残缺或与尾部分离、尾部变曲精子等，均视为畸形精子。 　　1.5精子DNA完整性的检测 　　将精液用PBS洗3次，弃上清，调整精子浓度为2×104个/mL，涂片，自然晾干，无水乙醇-冰醋酸（3 ∶1）固定 5 min，然后置入盛有新鲜配制的吖啶橙染液的染色缸中染色10 min。蒸馏水清洗，晾干后，石蜡油封片，于荧光显微镜观察、计数[3]。DNA 双链完整的精子呈现绿色，表明有受精能力；DNA 双链损伤的精子呈现红色或黄色，表明无受精能力，计数300个精子。 　　1.6扫描电镜样本制备 　　新鲜和试验1组冷冻-解冻精子样本于2.5%戊二醛中4 ℃固定6 h，再经PBS清洗3次，1次30 min；随后，将精子包埋于4%琼脂中，再于1%锇酸（OsO4）中固定1.5 h，然后再