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凉血退赤方含药血清对人脐静脉内皮细胞VEGFbFGFANG ―1及PEDF表达影响 　　摘要：目的研究凉血退赤方（LXTCF）含药血清对人脐静脉内皮细胞（ ECV304）血管内皮生长因子（VE（；F）、碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）、促血管生成素1（ANG-1）及色素上皮衍生因子（PEDF）基因及蛋白表达的影响，探讨其抑制角膜血管新生的可能作用机制。方法 制备LXTCF含药血清，以不同浓度的LXTCF含药血清（10%、20%）作用于ECV304，以正常大鼠血清（10%、20%）处理的ECV304为空白对照组，以单纯培养体系处理的ECV304为正常对照组。采用Western Blot.实时荧光定量PCR（RT一PCR）检测ECV304细胞VEGF、b-FCF、ANC-1及PEDF蛋白及基因表达的变化。结果 与空白对照组（ 20%）[（0.695±0.028），（1.28±0.08）]比较，20% LXTCF含药血清可明显降低ECV304细胞VEGF[（0.416±0.053），（0.56 +0. 13）]，b-FGF[（0.306±0.053），（0.64±0.11）]蛋白及基因表达（P0.05）。结论 下调VEGF和b- FCF基因及蛋白表达，从而抑制角膜血管新生，可能是LXTCI治疗CRNV性疾病的机制之一。 　　关键词：凉血退赤方；角膜新生血管；人脐静脉内皮细胞；血管内皮生长因子、人碱性成纤维生长因子、促血管生成素-1.色素上皮衍生因子 　　中图分类号：R285.5 　　文献标志码：A 　　文章编号：1007 - 2349（ 2015） 02 - 0061 - 04正常的角膜组织透明，是屈光介质之一。炎症失调、角膜移植排斥反应、碱灼伤、角膜溃疡、角膜干细胞缺失等呵引起角膜新生血管（ corneal neovascularization，CRNV）发生[1]。CRNV破坏了角膜的正常微环境，使眼前节相关免疫赦免偏离消失[2]，并导致持续性炎症和组织瘢痕化，产牛角膜混浊最终导致失明，因此，对CRNV发病机制和治疗方法的研究，一直是眼科领域的热点和难点。内皮细胞（ EC）在NV发生、形成过程中发挥着重要的作用[1]。本实验选用人脐静脉内皮细胞株（ ECV304）作为体外研究对象，从“热郁肝肺”认识CRNV，以“清肝肺郁热，凉血退赤”立论，探讨凉血退赤方（Li-ang Xue Tui Chi formula，LXTCF）抑制CRNV生成的作用及机制，为临床CRNV性疾病的治疗提供理论依据和治疗途径。1 材料与方法1.1 药物LXTCF药材组成为临床常用清热凉血药物密蒙花、生蒲黄、木贼、水牛角、海螵蛸等。药物由云南中医学院第一附属医院中药房提供，并经云南中医学院中药鉴定教研室鉴定。1.2 细胞人脐静脉血管内皮细胞（ HUVEC）株ECV304，购自广州吉妮欧生物科技有限公司。1.3 主要试剂RPMI-1640培养基购自CibcoBRL公司；胎牛血清购自Hyclone；RIPA蛋白提取试剂盒购白碧云天；总RNA提取试剂盒购自天根；逆转录试剂盒及SYBR Premix ExTaqⅡ均购自于TaKaRa；一抗兔抗大鼠抗体（bFGF、ANG-1、PEDF、VEGF）购自博尔森公司；二抗羊抗兔IRDye 800cw购自Li - Cor；内参GADPH购自cell signaling公司；引物（bFGF、ANG-1、PEDF、VEGF）均由大连宝生物工程有限公司合成。1.4主要仪器恒温C02细胞培养箱（Trermo公司，型号：3111）；红外荧光成像扫描系统（Gene公司，型号：OdysseyCLX）；ABI PCR仪（Gene公司，型号：Veriti）；安捷伦核酸扩增荧光检测仪（Gene公司，型号：MX3000P）。1.5方法1.5.1 含药血清的制备采用SPF级SD大鼠20只随机分为空白对照组与含药血清组。灌胃给药，每日早晚各1次，连续3d，给药组给药剂量为2 mU200 g（人临床等效剂量的10倍，相当于原生药的13.7 g/kg?d），空白对照组给予等容的蒸馏水。末次给药后lh腹主动脉取血，静置30min，3000转离心20min，取上清，56℃灭活30 min，0.22μm的针头滤器过滤灭菌，置于- 80℃冰箱保存备用。1.5.2 　　Western Blot检测含药血清对ECV304细胞VECF、PEDF、bFGF、ANG -1蛋白表达的影响ECV304以l×I06个/mL接种于6孔板。培养至细胞贴壁80010时，弃旧的培养基，给药组分别加入体积分数为10%、20%的含药血清的培养液，空白对照组加入10%、20%正常大鼠血清培养液。正常对照组加入等量培养液（10%胎牛血清），每组5个复孔，继续培养24h后，提取细