免疫组织化学技术 ectz_.pptVIP

细胞涂片制作 离心将细胞收集出来，用预冷的PBS洗2－3遍，最后用PBS将细胞重悬。 吸取30－50ul（可根据细胞量调整）滴至处理过的载玻片上，然后涂抹均匀。 待稍微风干以后加4％多聚甲醛溶液覆盖细胞，固定2－4小时。 在细胞上加一层甘油放-20℃保存。 * 荧光标记免疫组织化学 直接法 间接法 * 注意事项 一、抗体的保存 浓缩抗体：有效期内，只需放在 4℃冰箱内，保存时间可达1-3年。 即用型抗体：理论上在4 ℃冰箱内 可保存半年左右。 PBS或抗体稀释液稀释的抗体：一般 只可放置1-2个月。 * 二、出现假阳性的原因 组织切片质量不佳，造成假象，如刀痕裂缝边缘的组织着色过深，不能作为判断阳性的依据。 出血和坏死：红细胞的内源性过氧化物酶，坏死细胞释放的内源性过氧化物酶均可出现假阳性反应。 抗体的交叉反应。 * 三、出现假阴性的原因 固定时间过长，浸蜡、烤片温度过高，导致抗原丢失，无法补救。 固定液不合适或浓度不对，导致固定不佳。最好使用10%中性福尔马林。 抗体浓度过低。 孵育时间太短，或孵育温度太低。 缓冲液pH值不正确。 * 四、必须严格设置阳性对照和阴性对照。 五、DAB有致癌性，用后不应随处倒弃。 * * 免疫组化技术 * 1、定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（技术）。 2、基本原理 根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。? * 3、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1）免疫荧光方法? 利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。 * 2）免疫酶标方法 是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。 ?本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是： 定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。 免疫酶标方法目前在病理诊断中广为使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法检测系统等.。 * 4、被检测的物质 组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。 * 5、从蛋白水平检测角度，免疫组化技术与Western?blotting、ELISA的异同 1）Western?blotting：蛋白质免疫印迹，也是利用抗体抗原反应原理，结合化学发光等技术来检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法。与免疫组化技术相比，定量可能更加准确；当然Western?blotting也可定性和定位（通过提取膜蛋白或核蛋白、胞浆蛋白分别检测其中抗原含量，进而间接反映它们的定位），但敏感性远远低于免疫组化技术。 2）ELISA：酶联免疫吸附试验，也是利用抗体-抗原-抗原结合反应原理来检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测。与免疫组化技术相比，定量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一。 * 免疫酶标法下的两个实验流程简介 一、SP三步法 1）石蜡切片，常规脱蜡至水。 2）0.3%或3%H2O2去离子水（无色液体）孵育10-30分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。 3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟 4）候选步骤：采用抗原修复：微波（建议30分钟内4次中火）、高压、酶修复方法。自然冷却，再用3分钟×3次. 5）血清封闭：室温15-30分钟，尽可