利用一种耐热耐糖β葡萄糖苷酶制备黄芩素研究.docVIP

利用一种耐热耐糖β葡萄糖苷酶制备黄芩素研究 　　[摘要] 对利用一种耐热耐糖β葡萄糖苷酶水解黄芩苷制备黄芩素进行了研究。该酶催化黄芩苷转化为黄芩素的反应能在醋酸醋酸钠缓冲液中良好地进行，酶的最适pH 5.5，最适反应温度85 ℃，温度在85 ℃以下，pH 5～7.5酶的稳定性良好。酶的最大反应速率Vmax为0.41 mmol?L-1?min-1，米氏常数Km为3.31 mmol?L-1。不同的金属离子对酶的活性有不同的影响，醋酸醋酸钠缓冲液中的Na+对酶有活化作用。反应体系中葡萄糖醛酸浓度低于0.6 mol?L-1时，对酶有活化作用，当单糖浓度大于0.6 mol?L-1时，对酶有抑制作用，当单糖浓度达到1.2 mol?L-1时，酶活抑制率为50%，糖耐受性较好。通过实验得出较佳反应条件为黄芩苷酶液1 g∶0.2 mL，pH 5.5的醋酸醋酸钠缓冲液，反应时间为10 h时，反应温度为85 ℃，酶解率可达97%。 　　[关键词] 耐热；耐糖；β葡萄糖苷酶；黄芩苷；黄芩素 　　黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，首载于我国古代第一部本草著作《神农本草经》，其药用历史悠久，是我国广泛应用的传统名贵中药材之一。黄芩苷和黄芩素为中药黄芩中的主要有效成分，文献记载具有解热镇痛抗炎、抗菌抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、保护心脑血管、保护神经、保肝、治疗或预防糖尿病及其并发症、增强免疫、抑制变态反应等作用[13] 。黄芩中黄芩素含量很低，但是黄芩苷的含量很高，可达7%～19%[4]。而黄芩苷在人体内吸收差、 转化率低，研究表明：黄芩苷在肠内经过菌群作用转化为黄芩素而吸收，然后再于体内还原为黄芩苷，黄芩苷口服制剂需经胃肠道菌丛酶解转化为黄芩素后被吸收[56]。黄芩素的生物利用度和药理活性均高于黄芩苷，如抗艾滋病毒、诱导感染鸭子病毒细胞的凋亡，抑制艾滋病毒逆转录酶等作用等均远高于黄芩苷[7]，但在黄芩中黄芩素含量却很低、 而且易被氧和碱破坏、 生产成本高，从而使其应用受到了很大的限制。为此，人们致力于研究将黄芩苷转变为黄芩素。随着生物技术的发展，酶作为催化剂有专一性好，催化效率高，对环境污染小，且反应条件温和等优点，在工业应用上也正在越来越多地替代传统意义上的催化剂。本文研究了利用一种来源于热袍菌Thermotoga petrophila DSM 13995的β葡萄糖苷酶通过对黄芩苷的酶解来制备黄芩素的方法。 　　1材料 　　IKA磁力搅拌器；pH计（MettlerToledo FE20）；EYELA旋转蒸发仪；BurkerAV400 型核磁共振光谱仪； AE240 电子分析天平 （瑞士 Mettler公司）；Agilent 1100高效液相色谱仪；752紫外可见分光光度计， 上海光谱仪器有限公司； 黄芩苷自制，纯度95%（HPLC测定）；β葡萄糖苷酶；95%乙醇（食用级，连云港长和酒业有限公司）；黄芩苷，自制，纯度98%（HPLC测定）；黄芩素自制，纯度 98%（HPLC 测定）；HPLC用试剂（色谱纯，Oceanpak，瑞典）；其他试剂均为分析纯。 　　2方法 　　2.1β葡萄糖苷酶的制备和酶活力的测定 　　2.1.1β葡萄糖苷酶的制备 由南京林业大学赵林果教授实验室提供，其制备过程简述如下：将极端热袍菌T. petrophila DSM 13995中β葡萄糖苷酶基因（Tpebgl3）克隆转化到大肠杆菌JM109（DE3）宿主菌（购自Novagen公司），在含有氨苄青霉素（50 mg?L-1）的LB平板（LB培养基：胰蛋白胨10 g?L-1，酵母提取物5 g?L-1，NaCl 5 g?L-1，琼脂15 g?L-1）上经过37 ℃培养过夜，挑转化子到200 mL的LB培养基中（50 mg?L-1氨苄青霉素）37 ℃，200 r?min-1振荡培养至A600为0.6 h，加入终浓度为0.5 mmol?L-1异丙基βD硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导剂，30 ℃培养6 h，用高速冷冻离心机将培养液在4 ℃下，以13 000 r?min-1离心15 min，收集菌体，破碎菌体后加入缓冲盐，离心取上清液，经Ni亲和色谱柱纯化即得。 　　2.1.2酶活力的测定 准确称取黄芩苷1.0 g，加入到500 mL缓冲溶液中（用醋酸钠和0.5 mol?L-1的醋酸配制，pH 5.5） ，搅拌均匀，油浴加热至85 ℃时再加入β葡萄糖苷酶溶液0.2 mL，反应10 min后，加入50 mL 1 mol?L-1 Na2CO3溶液终止反应，用DNS法测定生成的葡萄糖醛酸的含量[89]。 　　酶活力定义为：在最适反应条件下，每1 min水解黄芩苷释放出1 μmol 葡萄糖醛酸所需要的酶量为1个酶活力单位（U）