中药熏蒸疗法对II型胶原you导型关节炎大鼠滑膜细胞.docVIP

　　中药熏蒸疗法对II型胶原诱导型关节炎大鼠滑膜细胞 【摘要】 目的观察中药熏蒸疗法对II型胶原诱导型关节炎（CIA）大鼠关节滑膜细胞IL-1β mRNA表达水平的影响，以探讨中药熏蒸疗法治疗类风湿性关节炎（RA）的机理。方法建立CIA模型，将雄性ethodsTo duplicate CIA model,the 40 male essenger RNA； CIA rats； Rheumatoid arthritis 　　类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种以慢性破坏性关节病变为特征的全身性自身免疫病［1］。其病因及发病机制尚未完全明确，但大量研究证实，RA滑膜细胞及滑膜组织中浸润的单核/巨噬细胞、淋巴细胞等产生的细胞因子在RA滑膜病变中起核心作用,在相关细胞因子中，尤其以IL-1β在RA的发生发展中起着重要的作用。我们运用中药熏蒸疗法治疗RA，在长期的临床实验观察中取得了良好的疗效。本研究采用半定量RT-PCR进一步研究中药熏蒸疗法治疗RA的分子免疫学机理。 　　1 材料与仪器 　　1.1 动物健康清洁级雄性70制冰机，Grant公司；微量有机分析专用超纯水机，颐洋企业发展有限公司；超低温冰箱，Forma Scientific公司；LD2X-40cI型立式自动电热压力蒸气灭菌器，上海申安医疗器械厂；超净工作台，苏州净化设备有限公司；紫外分光光度计，Biometra；凝胶成像系统，Syngene；DHG-91401型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司；低温离心机，美国Beckman公司产品；LEICA－RM2245型组织切片机；Lt2－12550酶标仪，澳大利亚Biocell公司产品；NIKON－E600显微镜，彩色摄象机，北京杰伟世音设备有限公司组装；电子天平JA2003，上海天平仪器厂；酶标仪，Biocecc htz，编号54809；生化培养箱，广东省正一科技有限公司，型号PYX-250S-B。按照文献合成引物，由上海生工生物技术有限公司合成IL-1β引物:正义链:5’-CTCGCTTGAGAGGTGCTGATGGTAC-3’,反义链: 5’-GAAGCTGTGGCAGCTACCTATGTCT-3’,扩增产物长度:519 bp;β-actin: 正义链: 5’-TTCCAGCCTTCCTTCCTGG-3’,反义链: 5’-TTGCGCTCAGGAGGAGCAAT-3’,扩增产物长度:226 bp。 　　2 方法 　　2.1 CIA大鼠模型复制和分组治疗将40只大鼠随机留取8只作为正常组，其余32只待造模，适应性喂养3 d。取10 mg小牛源II型胶原溶于配制好的0.1 mol/L乙酸5 ml，然后放置4℃冰箱内过夜，次日按2 mg/ml比例与弗氏不完全佐剂1∶1混合，用注射器反复抽吸,直至混合物完全、充分乳化，以乳化物滴入水中不松散为度（在冰浴中操作）；取乳化后大鼠CIA造模剂，于大鼠尾根部及左足底皮内按0.5 ml/只注射,并轻微压迫注射部位30 s，以使乳化物吸收完全。注射后第1天，部分造模组大鼠注射区局部皮肤发红、轻度肿胀、皮温升高，活动欠灵活；第2日部分造模大鼠左后足肿胀继续加重，并于3～7 d开始逐渐消退；至第8日按以上同样的方法再次注射0.3 ml/只，注意需避开上次注射部位；第14日大部分造模大鼠左后足和部分右后足关节出现肿胀、皮肤发亮、充血及关节活动受限；第21日大部分双后足关节及部分前足关节肿胀达到高峰，部分大鼠出现皮肤溃疡。多发性关节炎的出现表明大鼠CIA模型建立成功。造模后第21天，32只模型大鼠随机分成4组，模型组、水熏组、低熏组、高熏组各8只。正常组和模型组常规喂养，不做熏蒸处理；水熏组给予(57±1)℃蒸馏水熏蒸，蒸气温度为（39±1）℃；低熏组给予相同温度3.33%的中药液熏蒸；高熏组给予相同温度6.67%的中药液熏蒸。将大鼠放入自制动物熏蒸装置，开启电子恒温水槽，待蒸气温度达到熏蒸要求时，开始熏蒸并计时，熏蒸20 min/次，连续20 d。 　　2.2 大鼠滑膜细胞的获取、细胞因子mRNA的诱生和总RNA的抽提造模后第41天，以自配麻醉剂（5%盐酸氯胺酮注射液20 ml，2.5%盐酸异丙嗪注射液20 ml、0.05%硫酸阿托品注射液10 ml混匀），于每只大鼠腹腔注射0.6～0.8 ml，迅速麻醉，麻醉后心腔取血，后以颈椎脱臼法处死，取膝关节滑膜组织，液氮下保存待测，之后进行大鼠滑膜细胞总RNA的提取，其步骤如下： 　　2.2.1 匀浆取100 mg大鼠滑膜组织置于盛有适量液氮的碾钵中充分碾磨，每100 mg组织加1 ml的Trizol，颠倒EP管数次混匀，室温放置5 min，4℃ 12 000 r/min离心10 min，将上清移入另外一个离心管