中草药成药（口服液、蜜丸）的微生物检测.docVIP

中草药成药（口服液、蜜丸）的微生物检测 [适用对象] 药学、药学（医药营销方向）、药物制剂、中药学、中药学（国际交流方向）、制药工程、中药学（知识产权保护方向）专业 [实验学时] 2学时 一、实验目的 了解药物微生物学检测项目，掌握口服药物以及其他药物的微生物学检测过程。 二、预习与参考 药物中的微生物多来源于原材料和外界环境，中草药的原材料多为植物的根、茎、叶，受微生物污染的机会更多，为保证药物的质量，除对药物进行药效、药理学测定外还要进行微生物学的检测。根据给药途径和使用的不同，将药物限定划分为两类，一类为规定灭菌药物，它们包括注射剂、输液剂，体腔、眼科、烧伤、溃疡创面等用药。这类药物中绝对无活菌存在，因此要对这类药物进行无菌测试；另一类为非规定无菌药，包括各类口服药及皮肤外用药，这类药由于来源、制备条件等原因可能含有不同种类和数量的活的微生物，只要染菌量在药典规定的范围内且保证不含有特定的致病菌，一般对药物质量无大的影响。为保证药物的质量和用药的安全性这类药物中的微生物的种类和数量必须限定在一定范围内。因此要对这类药物进行微生物限度检测。 我国药典规定口服的不含生药粉的丸剂细菌总数小于1000，霉菌总数小于100，含生药粉的丸剂细菌总数小于30000，霉菌总数小于100；煎膏剂和糖浆剂，细菌总数小于100，霉菌总数小于100；不同的药物细菌的限定不同。大肠杆菌来源于人和动物的粪便，药物中检出大肠杆菌说明药物曾被粪便污染，可能存在其他肠道致病菌，因此药典规定口服的任何药物绝对无大肠杆菌存在。 三、实验内容 1、细菌、霉菌（包括酵母菌）计数——平皿菌落计数法 1)供试液的制备：无菌操作，取10ml中药口服液或10g蜜丸分别加入稀释液（生理盐水）90ml或100ml，混匀即为供试液。进一步稀释成1：100、1：1000等适宜的稀释级。 2）分别用无菌的吸管取不同稀释级的供试液1ml，置于直径90cm无菌平皿中，在加入准备好的无菌的约45℃的各种培养基（经过无菌和灵敏度测试的）15ml混匀待凝固后，倒置培养，每个稀释级应作2—3个平皿；另取稀释液1ml分别置4个无菌平皿中再加入细菌、霉菌的45 3）细菌计数培养用营养琼脂培养基，霉菌计数培养用玫瑰红钠琼脂培养基。 4）细菌培养温度为37℃，培养48小时，但在24小时、48小时可点计菌落数，以48小时为准，统计培养基上生长的菌落数，一般选取菌落数在30——300之间的平皿进行计数为好，然后乘以稀释倍数，即得每克或每毫升被检药物中的细菌总数。霉菌培养温度为25——28℃，培养72小时，但在48小时及72小时可点计菌落数，以72小时为准，一般选取菌落在5 2、大肠杆菌检查 1）取供试液10ml,加到100ml胆盐乳糖培养基，；再取10ml含50—100个菌（大肠杆菌）的对照菌液加到100ml胆盐乳糖培养基做阳性对照；最后取10ml稀释液加到100ml胆盐乳糖培养基做阴性对照。37℃培养18—— 2）取上述3种培养物各0.2ml分别接种置5mlMUG（4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基）培养基内，37℃ 3）在MUG培养管滴加靛基质指示剂，液面呈现玫瑰红色为靛基质试验阳性。 当阴性对照阴性（培养基不混浊、MUG阴性、靛基质阴性）；阳性对照细菌正常生长；供试液胆盐乳糖培养基澄清，MUG阴性，靛基质阴性，判断未检出大肠杆菌。相反，当阴性对照阴性；阳性对照细菌正常生长；供试液胆盐乳糖培养基混浊，MUG阳性，靛基质阳性，判断检出大肠杆菌。 4）若供试液MUG阳性，靛基质阴性或MUG阴性，靛基质阳性，应取供试液胆盐乳糖培养物划线接种于麦康凯琼脂平板， 37℃培养18—24小时，如无菌落生长，判断未检出大肠杆菌；有菌落生长，应挑取2—3个可疑菌落做靛基质试验（I）、甲基红试验（M）、乙酰甲基甲醇生成试验（VP）、枸橼酸盐利用试验（C） 四、主要仪器设备功能和材料清单 营养琼脂，玫瑰红钠琼脂， 胆盐乳糖培养基，需氧菌、厌氧菌培养基，MUG培养基，真菌培养基，麦康凯琼脂，生理盐水，无菌试管，无菌吸管，阳性对照菌（藤黄微球菌、生孢梭菌、白色念珠菌、大肠杆菌）。 五、实验要求 1、为使检测结果具有代表性，所测药物除随机采样外，还要求具有一定的量，每个批号至少抽样2盒或2瓶（检测用量的3倍量），每次检测从样品中取出的药量不能少于10ml或10g. 2、检测前药物不应开封，应保证原包装状态，置阴凉干燥处（防止细菌污染和细菌的繁殖）。 3、检测时一定注意无菌操作，稀释的药物样品2小时以内用完。 4、为排除药物中防腐剂和抑菌成分对测试结果的干扰，试验前用被检测的药物的稀释液作抑细菌和抑真菌试验，若测试的药品有抑菌作用，需用稀释法、中和法、薄膜滤过法消除抑菌性后，才可对该药物进行细菌检测。 5、试验前还要对所用的培养基进行