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南烛多酚氧化酶酶学性质初步研究 　　【摘 要】以南烛嫩叶为原料，粗制南烛多酚氧化酶（PPO）酶液，采用硫酸铵盐析、透析袋透析的方法，对南烛多酚氧化酶进行初步纯化，并对其酶学性质进行分析。结果表明：南烛多酚氧化酶的最适pH为6.5，最适温度为45℃左右，最适底物为邻苯二酚，本实验为南烛黑色素的制备提供了一定的参考依据。 　　【关键词】南烛；多酚氧化酶；酶学性质 　　南烛（Vaccinnium Bracteatum Thunb）属于杜鹃花科越橘属，在江浙、福建、湖广一带，人们以其茎叶浸渍染米加工乌饭。南烛黑色素作为一种植物来源的黑色素，安全性高，受到广泛关注。魏国华等学者提出南烛黑色素的形成可能与酶相关[1-2]，王敬文等人在制备南烛黑色素的过程中，加入一定量的多酚氧化酶或其它类型的酶，得到了颜色更黑的南烛叶黑色素提取液[3]。多酚氧化酶是一种含铜的金属酶，可以用一元酚和二元酚作底物，是发生酶促褐变的主要酶，存在于大多数果蔬细胞组织中。本文对南烛叶中的多酚氧化酶进行分离纯化，并对其酶学性质的进行初步探究，为南烛黑色素的制备提供了一定的参考。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料和仪器 　　磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、曲通拉X-100、硫酸铵、聚乙烯吡咯烷酮、L-多巴、邻苯二酚、L-酪氨酸、绿原酸、愈创木酚、儿茶素、焦性没食子酸。透析袋（分子量：14400）；可见分光光度计；冷冻离心机；磁力搅拌器；pH计；紫外探头型可见光谱仪；电热恒温水浴锅。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 粗制酶液 　　取适量新鲜南烛嫩叶，加入磷酸盐缓冲液（0.1 M，pH6.5），料液比1：5，加入1 %聚乙烯吡咯烷酮以及0.25%的曲通拉X-100，低温匀浆30min，离心（10000rpm，5min，4℃）取清液，即为粗制酶液，4℃保存备用[4]。 　　1.2.2 酶活性的测定 　　分光光度计比色法：2.0ml的磷酸盐缓冲液 （0.1M）和0.9ml的邻苯二酚（0.01M）的混合液，0.1ml酶液，恒温5min，混匀，迅速测定反应体系在420nm吸光度变化，以最初直线段的斜率计算酶活力。空白对照：邻苯二酚溶液/磷酸盐缓冲液的混合液。PPO酶活性的定义：每分钟吸光值（420nm）变化0.001定义为1个酶活力单位，及1U，PPO酶活性表示为103×A420/min[4]。 　　1.2.3 分离纯化 　　粗酶液中加入硫酸铵，使其饱和度达到20%，4℃下静置4h，然后在10000rpm/min、4℃条件下离心10min，分离沉淀物。将盐析得到的蛋白溶于0.01M磷酸盐缓冲液后，透析除盐，于4℃透析24h，每4h更换透析液[5]。 　　1.2.4 数据统计与分析 　　每个实验3个平行2个重复，利用Excel软件统计分析数据，计算标准偏差并制图。 　　2 结果与分析 　　2.1 pH对南烛PPO酶活性的影响 　　以邻苯二酚为底物，研究pH对酶活性的影响，配制不同pH的磷酸盐缓冲液，构建不同pH（3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5）的反应体系，37℃测定酶活，以各pH条件下测得的最高酶活作为100%计算相对酶活，结果如图1所示。pH对南烛叶PPO的酶活性影响非常明显：在pH值3.5-5.5的之间，随着pH值升高，南烛叶PPO酶活性先升高后降低，在pH值为4.5时酶活性较大；pH值继续变大，PPO的酶活力出现相同变化，但酶活性增强，pH值为6.5时酶的活性最高。因此，以邻苯二酚为底物时南烛叶PPO酶的最适pH为6.5。 　　2.2 温度对多酚氧化酶活性的影响 　　以邻苯二酚为底物，研究温度对PPO活性的影响。在pH 6.5条件下，在不同温度（5、15、25、35、45、55 ℃）条件下，以各温度条件下测得的最高酶活作为100 %计算相对酶活（图2）。在15℃-45℃之间，PPO活性随温度升高而增加；在45℃-65℃之间，多酚氧化酶活性随温度升高而下降；以邻苯二酚为底物，在pH6.5条件下，45℃左右时南烛叶多酚氧化酶表现出最大酶活性。 　　2.3 PPO酶的米氏常数 　　用磷酸盐缓冲液（pH6.5）分别配制浓度为5、10、20、50、100mM的底物溶液，分别测定不同底物在不同浓度条件下的酶活反应初速度，并采用Lineweaver-Burk双倒数法作图，计算底物的Km、Vm值[4]，结果如表1所示。由结果可知，儿茶素对南烛叶多酚氧化酶的Km值最小，有最好的亲和力，但综合考虑Vmax/Km的值大小，南烛叶多酚氧化酶最合适的底物为邻苯二酚。 　　3 讨论 　　由于酶的大多数为蛋白质，凡能影响蛋白质的理化因素都可能影响酶的结构与功能，影响酶促反应的因素主要有底物、pH、温度、抑制剂及激活剂等。首先酶在催化反应时，