反复力竭游泳应激对大鼠海马结构神经元型一氧化氮合酶表达影响.docVIP

反复力竭游泳应激对大鼠海马结构神经元型一氧化氮合酶表达影响 　　摘　要：为探讨海马结构(海马和齿状回)神经元型一氧化氮合酶(nNOS)与运动疲劳应激的关系，观察反复力竭游泳所引起的疲劳应激对大鼠海马结构nNOS表达的影响。经4周力竭游泳训练制成大鼠运动疲劳应激模型，用免疫组织化学方法显示海马和齿状回nNOS阳性神经元，用图像处理半定量方法对该神经元的数量、面积和灰度进行测量和分析。结果显示：应激实验组大鼠海马和齿状回nNOS免疫阳性神经元数量、面积和灰度均明显大于对照组(P0.05，P0.01，P0.001)。运动疲劳应激可使大鼠海马结构神经元nNOS上调，该神经元参与运动疲劳应激的形成，其机理可能与海马对情绪记忆和齿状回对应激反应的l心理行为调节以及NO的神经毒性有关。 　　关键词：疲劳；应激；海马结构；神经元型一氧化氮合酶(nNOS)；大鼠 　　中图分类号：G804.4文章编号：1009―783X(2010)04―0093―04 文献标志码：A 　　 　　运动性疲劳是运动医学研究的热点之一，除了周围神经肌肉疲劳引起的生理病理变化逐渐被研究者了解以外，运动疲劳时中枢神经系统出现的生理病理变化报道较少，其机制复杂且受精神心理等因素的影响，未取得一致的结论。本课题组对疲劳应激时脑内下丘脑、杏仁体和伏隔核等神经元型一氧化氮合酶(nNOS)的表达进行了系列研究，证明反复力竭游泳应激与大鼠脑内某些核团NO／nNOS有一定关联。 　　海马结构(hippocampal formation，HF)包括海马(hippo―campus)和齿状回(dentate gyrus)，共属于边缘系统，是脑发育较古老的结构。海马和齿状回在发生发育、结构和功能上有密切联系，如参与学习、记忆和情绪反应等。海马既介导应激状态下的神经内分泌反应和可塑性调节，又参与学习记忆及情绪反应等精神活动，故成为探讨应激与神经精神疾病(包括运动性中枢疲劳)相互关系研究中的热点之一。为进一步了解疲劳应激时其他重要神经核团一氧化氮合酶(NOS)的变化，本文应用大鼠反复力竭游泳模型和免疫组织化学方法对海马结构与疲劳应激的关系进行了探讨。 　　 　　1　材料与方法 　　 　　1.1　动物及分组 　　雄性Wister大鼠(山西医科大学实验动物中心提供)20只，体重180―200g，随机分为疲劳应激组10只，对照组10只。标准啮齿类饲料饲养，活动自由，适应环境3d，记录动物体重。室温(20±2)℃，湿度(45±10)％，光照每天14h。 　　 　　1.2　游泳训练模型 　　1.2.1　游泳环境 　　游泳池为圆形，内径50cm，水深60cm，水温控制在(30±1)℃。 　　1.2.2　力竭游泳方案 　　实验组适应性游泳3d，剔除不擅游泳者。每天力竭游泳1次，每周6d。力竭游泳标准为：大鼠游泳动作失协调，水淹没鼻尖，身体下沉，至再次浮出水面的时间超过10s，并连续3次者。提出水面后头不能抬起，无力挣扎逃跑。对照组大鼠佯装游泳，即在同样条件下2―3cm水深中跋涉。 　　1.2.3　疲劳应激模型建立 　　4周游泳训练后大鼠精神萎靡，食量下降，反应性降低，脱毛，体重不增或略有降低，提示运动性疲劳已经形成。 　　 　　1.3　取材切片 　　大鼠经2％戊巴比妥钠(45mg／kg)腹腔麻醉后，开胸，升主动脉插管，用300ml冷生理盐水快速冲洗，直至流出液体变清为止。继之灌入4％多聚甲醛(0.1moI／L PBS，pH7.4―7.4，下同)300mI，再以10％蔗糖PBS溶液300ml灌注。灌注结束立即取脑，置于4％多聚甲醛PBS溶液中，4℃后固定3h，然后移入20％蔗糖PBS溶液中，4℃保存过夜。作脑冠状位连续冰冻切片，片厚40μm。 　　 　　1.4　ABC免疫组织化学染色 　　兔抗nNOS血清(抗体稀释度为1：100)，兔ABC试剂盒和DAB等，均购自北京中杉生物技术有限公司。冰冻切片经室温平衡，水化后按以下步骤进行。切片经0.5％TritonX-100PBS液孵育，37℃，1h；10％正常羊血清封闭，37℃，1h；加入兔抗nNOS血清第一抗体，37℃孵育3h后，4℃孵育36h；加入生物素化羊抗兔第二抗体(稀释度为1：100)，37℃孵育1h；后入卵白素生物素复合物(稀释度为1：100)中，37℃孵育1h；以上各步骤之间均用PBS漂洗5min×3次；DAB呈色，缓冲液中止显色，反复漂洗。0.2％明胶裱片，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。 　　阴性对照组：分别以正常兔血清和PBS代替第一抗体孵育，对照组未发现阳性物出现，即无特异性反应。 　　 　　1.5　统计学处理 　　所有实验数据用平均数土标准差表示，显著性差异用Ex―cel软件做t