双藤痹痛凝胶对CIA大鼠外周血调节性T细胞作用研究.docVIP

双藤痹痛凝胶对CIA大鼠外周血调节性T细胞作用研究 　　【摘 要】 目的：分析双藤痹痛凝胶对胶原免疫性关节炎大鼠外周CD+4CD+25FoxP3+Treg 细胞的调节作用。方法：Wistar大鼠50只，随机分成5组，分别为正常组、模型组、双藤痹痛凝胶高剂量组、中剂量组、低剂量组，胶原蛋白诱导大鼠关节炎，并采用流式细胞术检测大鼠外周血CD+4CD+25FoxP3+Treg及酶联免疫吸附试验检测血清中IL-6表达水平。结果：与模型组比较，双藤痹痛凝胶高、低剂量组大鼠外周血CD+4CD+25 T细胞及CD+4CD+25FoxP3+Treg细胞水平显著升高，且高、中剂量组血清IL-6水平显著下降。结论：双藤痹痛凝胶治疗类风湿性关节炎可能通过上调外周血CD+4CD+25FoxP3+Treg细胞表达水平，降低血清IL-6水平，从而恢复免疫耐受作用。 　　【关键词】 双藤痹痛凝胶剂；类风湿性关节炎；调节性T细胞 　　【中图分类号】R2855 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）23-0033-03 　　类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis，RA），是一种慢性全身性自身免疫性疾病，属于中医学“痹证”范畴，临床常出现关节疼痛，肿胀，僵直，变形等症状，病情反复，严重影响患者的生活质量[1]。双藤痹痛凝胶为我院院内制剂双藤痹痛酊（批准文号： 闽药制 的基础上研制而成的新型制剂，凝胶剂是一种以水溶性高分子化合物或亲水性物质为基质，与中药或中药提取物混合后，涂布于布上制成的外用贴剂，具有透气性好、载药量大、耐汗性强，可反复黏贴，不污染衣物，药物无致敏、无刺激性等副作用。前期临床及动物实验证实其具有抑制 CIA 模型大鼠足趾肿胀和关节组织病理学改变，降低其关节炎指数的作用[2]。近年的研究发现调节性T细胞的功能与数量对RA等自身免疫系统疾病的发生、发展具有重要的影响，特别是对CD+4CD+25FoxP3+Treg细胞的影响，它可能成为治疗类风湿性关节炎的新策略和途径，因此，本文旨在探讨双藤痹痛凝胶是否通过调节CD+4CD+25FoxP3+Treg细胞，而发挥抗RA的作用。 　　1 材料与仪器 　　11 动物 Wistar大鼠50只，雌雄各半，SPF级，体重（220±20） g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号：SCXK（沪）2007-0005，均由福建中医药大学动物实验中心提供，动物适应性喂养1 周后开始试验。 　　12 药物与试剂 药物 双藤痹痛凝胶，由福建中医药大学药学院提供，每片（8cm×12cm） 含雷公藤甲素24659μg，含青藤碱15589mg；空白凝胶膏剂，由福建中医药大学药学院提供。试剂弗氏完全佐剂（chondrex公司，批号：7002），Ⅱ型胶原（chondrex公司，批号：2002-2）；APC-抗CD4 mAb（批号：551980）、PE-FoxP3 mAb（批号：560046）、IL-6酶联免疫吸附试验试剂盒（批号：F1567）均购于Bioscience公司，FITC-抗CD25 mAb（批号：553071）购于Biolegend公司，红细胞裂解液购自美国BD公司。 　　13 仪器 CS-1EAS型电子天平（北京市菲姆斯科技开发公司，精度01g）；TGL-16G台式离心机（上海仪分科学仪器有限公司）；InfiniteM200 Pro多功能酶标仪（TECAN）；FACSCalibur型流式细胞仪（美国BD公司）。 　　2 方法 　　21 大鼠CIA模型的建立[3-4] 取50只Wistar大鼠，随机分成五组，每组10只，用刮毛刀刮去大鼠背部毛，以供贴药。将弗氏完全佐剂（FAC）与2mg/mL的Ⅱ型胶原乳液等体积混合，制成1mg/ml的胶原乳剂，除正常组外，按每只大鼠02mL乳剂（含CⅡ02mg）于尾根部皮下注射造模。7d后强化1次，除正常组外，按每只大鼠01mL乳剂（含CⅡ01mg）于尾根部皮内注射造模。 　　22 实验分组及给药 除正常组外，其余各组（模型组、双藤痹痛凝胶膏剂高、中、低剂量组）动物初次免疫后次日起开始给药，将药物贴于大鼠背部后，并用医用胶布固定；每日给药1次，连续28d。其中模型组为空白凝胶膏剂，大小为2cm×3cm；高、中、低剂量给药组分别给于大小为1cm×3cm、2cm×3cm、3cm×3cm的双藤痹痛凝胶膏剂。 　　23 流式细胞术检测外周血CD+4CD+25FoxP3+Treg 摘眼球取血，肝素抗凝收集；取血100μL，加入含有05μLCD4-FITC和25μL CD25-APC单克隆抗体的离心管中，室温避光孵育30min；加入1mL红细胞溶解液混匀，以1500r/min离心5min，弃其上清液；加入1mL