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响应面优化酶法提取花生壳黄酮类化合物工艺研究 　　摘要：利用响应面分析法对纤维素酶辅助提取花生（Arachis hypogaea Linn.）壳黄酮类物质的条件进行优化。首先采用单因素试验分析pH、酶量、酶解温度、酶解时间对花生壳黄酮类物质含量的影响，然后利用Box-Behnken试验设计及响应面分析法对其提取工艺进行了优化。结果表明，花生壳黄酮最佳的提取工艺为pH 5.7，酶量7.3 mg/g，酶解温度58 ℃，酶解时间2.7 h，在此工艺条件下黄酮提取量为（2.300±0.002） mg/g，总黄酮提取量的验证结果与模型预测相符，该提取工艺稳定可行。 　　关键词：花生（Arachis hypogaea Linn.）壳；响应面；黄酮类化合物；纤维素酶 　　中图分类号：S565.2；R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）06-1532-06 　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.06.043 　　花生（Arachis hypogaea Linn.）是重要的植物油资源，其种植范围遍及全世界。近年来，中国种植花生的面积和产量居世界前列。一直以来，花生仁是人们所研究的重点，而花生壳大部分被丢弃或作燃料使用，使得花生的综合利用率大大降低，花生壳中含有丰富的碳水化合物、粗纤维、甾体化合物和黄酮化合物等[1]。黄酮类物质具有抗氧化、抑菌、抗病毒、降血脂等作用[2-7]。因此，对花生壳黄酮类化合物的提取是研究的热点。目前报道的花生壳黄酮提取法主要有微波辅助法[8-11]、回流提取法[12，13]、热浸提法[14]等，但未见采用酶法提取花生壳黄酮类化合物的报道。酶辅助法提取植物活性成分，具有快捷、高效、无毒、反应条件温和等优点。为充分利用酶辅助法的优点，本试验运用响应面分析方法探讨花生壳黄酮类化合物的最佳酶法提取工艺。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　花生壳样品来自湖南，干燥、粉碎，过80目筛，烘干备用。 　　试剂：纤维素酶（40 U/mg）、芦丁标准品、无水乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠等。 　　1.2 方法 　　1.2.1 标准曲线的制作 标准曲线的制作方法按照文献[15]，得到回归方程为：A=9.489 3C-0.022 3（R2=0.995 9）。 　　1.2.2 黄酮化合物提取工艺 花生壳→粉碎→过80目筛→酶解→高温灭酶→减压过滤→滤渣烘干→95%乙醇浸提→浓缩过滤→测定黄酮提取量。 　　1.2.3 总黄酮提取量的测定 将提取液用95%的乙醇定容，在波长510 nm测定样品吸光度，代入回归方程得出样品中黄酮类化合物的含量，并计算黄酮提取量，公式如下： 　　黄酮提取量=C×V/W 　　式中，C为花生壳黄酮类化合物质量浓度（mg/mL）；V为样品溶液体积（mL）；W为花生壳质量（g）。 　　1.2.4 单因素试验 分别选择pH（3.4～6.4）、酶量（3～9 mg/g）、酶解温度（35～65 ℃）和酶解时间（1.0～4.0 h）（料液比1∶30、溶剂95%乙醇）为因素，进行单因素试验。 　　1.2.5 响应面法优化试验 选取pH、酶量、酶解时间、酶解温度为因素，根据单因素试验的结果，设计Box-Behnken试验，采用4因素3水平的响应面方法分析得到花生壳黄酮的最优工艺参数，试验因素与水平设计见表1。 　　2 结果与分析 　　2.1 单因素试验 　　2.1.1 pH对总黄酮提取量的影响 pH是影响酶活性的一个重要因素，每种酶都有一个自己最佳的pH，在此pH下催化反应的速率最高。由图1可知，当pH在3.4～5.8，花生壳黄酮类化合物提取量随着pH的增加而增加，当pH达到5.8时，其提取量达最大，之后随pH的继续增加，总黄酮提取量反而呈下降趋势。当pH 5.8时，纤维素酶能够发挥最大的酶活性，最大程度的破坏花生壳细胞壁，减少传质阻力，加速花生壳黄酮类化合物的溶出。 　　2.1.2 酶量对总黄酮提取量的影响 由图2可知，当酶量在3～7 mg/g，总黄酮提取量随着酶量的增加而增加，当酶量达到7 mg/g时，其总黄酮提取量达到最大，之后随酶量的增加，总黄酮提取量反而呈下降趋势。这是因为纤维素酶量达最适值时，对花生壳的酶解完全，其黄酮类化合物的溶出率最大；当酶量低于最适值时，酶解未进行完全，总黄酮提取量较低；当酶量大于最适值时，酶和底物之间的吸附已经达到了饱和，没有多余的底物与之结合，导致酶的作用受抑制。因此，选择酶量为7 mg/g最合适。 　　2.1.3 酶解温度对总黄酮提取量的影响 由图3可知，当酶解温度在35～60 ℃时，随着酶解温度的升高，酶活性增强，反应速度加快，有利于花生壳黄酮类化合物的溶出，总黄酮提取