第三讲 技术方法-一幻灯片.pptVIP

氰戊菊酯处理土壤样品的PCR－DGGE图谱分析 2. PCR-SSCP（PCR-restriction fragment length polymorphisms）方法 PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。 单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的 当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变 空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同 因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开 方法原理 DNA片段长度应使用的丙烯酰胺浓度 DNA片段长度（核苷酸数） 丙烯酰胺（%） 1kb～700b 3.5 700b～500b 5 500b～200b 8 200b 12 DNA链大小 DNA链的自身结构 温度 电压 影响DNA迁移率的因素： 注意事项 核酸片段的大小:? 核酸片段越小，检测的敏感性越高。对于200bp的片段，可发现70％变异；300bp能发现50％的变异；＞500bp的片段，仅能检出10％～30％的变异（150bp左右较好） 电泳温度: 保持凝胶内温度恒定是SSCP分析最关键的因素。 凝胶的浓度、厚度及长度:一般使用5％～8％的凝胶，尽量使凝胶越薄越好，凝胶板长度在40cm以上。 假阴性: 如没有污染，PCR－SSCP分析不存在假阳性结果，但可能出现假阴性结果，由于点突变引起的空间构象变化甚微，迁移率相差无几所致，尤其是点突变发生在扩增片段的两端时。应通过设置阳性对照，摸索电泳条件，假阴性结果在很大程度上是可以避免的 结果分析: 一般形成两条单链带。PCR产物进行单链凝胶电泳之前，通过加热变性产生单链。如变性不彻底，残留双链亦可形成一条带．因此，PCR－SSCP分析结果至少显示三条带。 3. PCR-RFLP（PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism）方法 当DNA或RNA分子由于单碱基突变或序列重 排，使某种酶切位点增加、减少或消失，导致限制性酶切片段长度发生改变，就产生 了限制性片段长度多态性，由于限制性内切酶在DNA分子上有特异的酶切位点，根据 其识别序列的位置和数量，可以把大小相似而序列有差异DNA切割成不同的片段通过 核酸电泳，可将长度不等的DNA片分离而显出其长度多态性(片段的大小)。 4. PCR-T-RFLP（PCR-Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism）方法 T-RFLP 是以荧光标记引物PCR为基础,根据末端限制性片段长度区分出微生物群体组成的一种微生物群体图谱法. 原理 选取具有系统进化标记特征的DNA序列为目的序列 用荧光物质标记1个或2个引物的5’端 PCR产物用四碱基限制性内切酶进行消化，用测序仪识别标记末端，得到不同的末端片段峰，每一个峰可至少代表一种类型的微生物 根据峰的大小和数量，分析出微生物群体的组成和动态变化。 常用的荧光物质： 四氯荧光素TET(5-tetrachloro-fluorescein) 绿色的六氯荧光素HEX(5-hexachloro-fluorescein) 蓝色的六羧基荧光素6-FAM (6-carboxy-fluorescein) 细菌 真菌 真菌+细菌 305bp 306bp 307bp 308bp 310bp 芽孢杆菌 注意事项 （1）DNA模板的完整性 （2）标记性DNA序列区段的特异性 （3）标记性DNA的扩增 （4）四碱基限制性内切酶的选择（ HaeⅢ、HinfⅠ、MspⅠ ） 选酶原则 （1）能够明显区分出不同的微生物，即产生的末端片段峰大小区别明显,尽量避免只差一个碱基的情况 （2）消化后产生的单峰具有特异性,产生的杂峰尽可能少 细菌16S与23S rRNA基因之间的大小核糖体基因间隔序列ITS(Internal Transcribed Spacer)逐渐被关注。该区段具有变异性强、分化程度高等特点,其变异速率为16S rRNA基因的10倍。 5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 TaqDNA聚合酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针 TaqMan法工作原理 每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光 R Q 5’ 3’ 5’ 3’ Exc