细菌形态与结构的检查方法.docVIP

细菌形态与结构的检查法 [适用对象] 中医学（骨伤方向）、针灸推拿学专业 [实验学时] 3学时 一、实验目的 1、学会显微镜油镜的使用和保护方法。 2、认识细菌的基本形态和特殊结构(荚膜、鞭毛、芽胞)。 3、掌握革兰氏染色方法。 4、了解细菌的动力。 二、实验原理 1、显微镜油镜的使用原理: 观察细菌必须用放大1 000倍左右的油镜。油镜的透镜极小，工作焦距最短,光线通过玻璃和空气，由于介质密度不同发生折射，射人镜筒的光线极少，视野暗、物象不清晰。如在玻片与镜头（透镜）之间加上折光率和玻片（n=1.52）相近的香柏油（n=1.515）就可减少光线的折射，加强视野的亮度，获得清晰的物像。 2、革兰染色法的原理：主要是革兰阳性菌与革兰阴性菌细胞壁有差异，另外革兰阳性菌的等电点比革兰阴性菌低，与碱性染料的亲和力强。 三、仪器设备 1、显微镜 2、细菌标本片：(1)葡萄球菌(革兰染色)(2)大肠杆菌(革兰染色(3)霍乱弧菌(革兰染色)(4)伤寒杆菌(鞭毛染色)(5)肺炎球菌(荚膜染色(6)破伤风杆菌(芽胞染色) 萄球菌、绿脓杆菌的琼脂斜面18～24小时培养物。 4、染色液有结晶紫、碘液、95％酒精、稀释石炭酸复红。 四、相关知识点 细菌是一类体积微小的单细胞原核细胞型微生物，活的菌体小而透明，当把细菌悬浮于水滴内，用普通光学显微镜观察时，由于菌体和背景没有显著的明暗差，因而难以看清它们的形态，更不易是别其结构，所以，用普通光学显微镜观察细菌时，往往要先将细菌进行染色，借助于颜色的反衬作用，可以更清楚地观察到细菌的形状及某些细胞结构。因此，为了研究细菌的形态特征和鉴别不同类群的细菌，细菌的染色及形态构的观察是位生物学实验中十分重要的基本技术。 五、实验步骤 显微镜油镜的使用 显微镜使用方法 ①将显微镜平稳的安放在试验台适宜处②用低倍镜对光，调节反光镜，天然光源用平面反光镜，人工光源或光线较弱使用凹面反光镜。检查染色标本要用强光，应将聚光器升到最高，光圈完全开大；若检查未染色的活体标本则用弱光，聚光器适当下降，光圈适当缩小。③标本片上加镜油一滴，转动粗螺旋，使油镜头缓缓下降，用眼从侧面观察，直到油镜头浸入油中接近玻片为止(注意下降油镜头时不要用力过猛过急，以免压碎玻片或损坏镜头)。④用左眼从接目镜观察，徐徐转动粗螺旋提升镜头，见模糊物像后再用细螺旋调节即见到清晰物像为止。⑤油镜头使用后应立即用擦镜纸擦净镜头上的油。如油已干，可在镜头纸上滴少许的二甲苯擦拭，并立即用干的擦镜纸擦去二甲苯，因二甲苯能溶解镜头上的固定胶以致使镜片脱落，所以应及时擦去二甲苯。 显微镜的保护 ①显微镜是精密仪器，使用时要精心保护，不得随意拆散和碰撞，所有光学部分都不能用手指、布、普通纸擦拭。② 取送显微镜时应右手持镜臂，左手托镜座，平端于胸前。③显微镜的光学部分应避免日光直射。④不用时，将接物镜转开成八字降至最低，使其不对准聚光器，聚光器下降，罩上镜套或放到显微镜箱中。 观察细菌的基本形态与特殊结构 1、用油镜观察下列细菌的示教片 (1)葡萄球菌(革兰染色) (2)大肠杆菌(革兰染色 (3)霍乱弧菌(革兰染色) (4)伤寒杆菌(鞭毛染色)(5)肺炎球菌(荚膜染色 (6)破伤风杆菌(芽胞染色) 注意：各菌的形态、排列和染色性以及特殊结构特点等性状。 2、将观察到的结果，画在报告纸上并加以适当的描述。 注意：微生物标本片，多用涂片法制成，观察完毕，不能用力擦去玻片上的镜油，只能用擦镜纸轻轻压吸或滴一滴二甲苯用擦镜纸轻拉。示教片看完处理后应放回原处，自己涂的玻片看完后应放入消毒缸内。 革兰染色法 1、细菌标本片的制作 (1)涂片：无菌操作。取一接种环生理盐水放于载玻片的一端，，用接种环刮取少许绿脓杆菌或葡萄球菌培养物与盐水混匀，涂布成直径约lcm的涂片(若采用液体培养物，勿加生理盐水，直接采取1～2环菌液即可)。涂片应薄而均匀。 (2)干燥：涂片最好在温室中自然干燥。必要时可将标本面向上，在酒精灯上方微火处借热收干。 (3)固定：标本面向上，在酒精灯火焰外层按钟摆的速度来回通过3次。放置待冷后，进行染色。固定的目的是杀死细菌，使细菌与玻片粘附较牢，在染色时不致于被染液和水冲掉；另外固定能使细菌蛋白质变性，提高细菌对染料的亲和性。 2、染色 (1)初染：滴加结晶紫染液于涂片上，1分钟后用自来水缓缓冲洗。 (2)媒染：滴加碘液，1分钟后用自来水缓缓冲洗。 (3)脱色：加95％酒精，边摆动玻片使酒精流去边观察，直至流下的酒精无色或稍呈淡紫色时为止(约20～30秒钟)，及时用自来水缓缓冲洗。 (4)复染：滴加稀释石炭酸复红液，30秒～1分钟后用水缓缓冲洗。 自然干燥或用吸水纸吸干后，加一滴香拍油，油镜检查，注意观察菌体的形态、排列及染色性。 六、实验报告要求 根据染色观察结果，绘