土壤中茄科雷尔氏菌实时荧光定量PCR快速检测体系建立与应用.docVIP

土壤中茄科雷尔氏菌实时荧光定量PCR快速检测体系建立与应用 　　摘要：根据茄科雷尔氏菌eg1基因，设计1对特异性引物，建立并优化实时荧光定量PCR反应体系，并对土壤中的茄科雷尔氏菌进行检测和评估。对采自云南省文山州5个县的100份青枯病带菌土壤进行检测，结果表明，100份土壤样品中，广南县15、22、24号，丘北县31、35、43号，麻栗坡县62、67、68号，马关县70、74、78、79、80、83、84号，共16份土壤样品中茄科雷尔氏菌含量大于105 CFU/mL，预测细菌性青枯病发病风险较高；广南县12、20、21、23、26、27、29号，丘北县30、33、34、37、38、39、46、48号，麻栗坡县50、52、54、58、59、60、61、63、64、65、66、69号，马关县71、72、73、75、76、77、81、82、85、86号，砚山县1、2、4、5、7、9号，共43份土壤样品检测出的茄科雷尔氏菌含量在104～105 CFU/mL之间，预测细菌性青枯病发病风险中等；其他土壤样品检测出的茄科雷尔氏菌含量均小于103 CFU/mL，预测细菌性青枯病发病风险低，其中砚山县3、10、87、88、89、90号，广南县14、19、25、28、91、92、93号，丘北县32、36、44、49、94、95、96号，麻栗坡县51、57、97、98、99、100号，共26份土壤样品中未检测出茄科雷尔氏菌。 　　关键词：茄科雷尔氏菌；实时荧光定量PCR检测；快速检测体系；细菌性青枯病 　　中图分类号： S432.4+2文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2017）14-0017-03 　　茄科雷尔氏菌[Ralstonia solanacearum （Smith） Yabuuchi et al.]是世界上最重要的植物病原细菌之一，广泛分布于热带、亚热带及温带地区。该病原细菌的寄主范围较广，可侵染55科数百种植物[1]。在我国，已报道有番茄、辣椒、茄子、马铃薯、烟草、花生、生姜、沙姜、桑、蕹菜、桉树等10余种作物受到该病原细菌的危害，造成细菌性青枯病。该病原菌主要在土壤中及遗落土中的病株残体上越冬，通过根部?p叶柄或茎部的伤口侵入后，在维管束内繁殖，并沿维管束向上发展，以致维管束阻塞，腐烂变褐，茎、叶因得不到水分、养分的供应而萎蔫[2]。调查研究表明，由该病原菌造成的烟草青枯病极为严重，给我国西南地区及长江下游流域的烟草生产带来了很大威胁[3]。其中个别年份烟草青草枯病暴发流行，发病重的地?K，产量损失达 80%左右，造成毁灭性损失[4]。此外，受该病原菌感染的番茄、茄子、辣椒等茄科作物的产量会大幅减少，带来严重的经济损失[5-7]。因此，对温室或大田可能存在的病菌进行早期检测，对于适时控制病害的发生有着极为重要的意义。 　　近年来，随着分子生物学技术的快速发展，实时荧光定量PCR技术在植物病害研究上也不断深入并广泛在多种病原菌定量检测中应用，极大地提高了植物病害的检测效率[8-11]。Nicholson等利用实时荧光定量技术建立了小麦茎基部病原物的定量检测方法[12]；潘娟娟等利用 RT-PCR 技术建立了定量检测小麦条锈菌（Puccinia striiformis f. sp. tritici）潜伏侵染的方法，对小麦条锈病进行早期检测，指导病害的预测[13-14]。目前，国内外未有利用该方法对茄科雷尔氏菌进行检测的报道，本研究拟查阅文献并分析茄科雷尔氏菌基因序列的保守区，设计相关的荧光定量PCR的特异性引物，并应用建立的方法对采自云南省各个地区土壤中的病原菌进行早期检测。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）标准菌株Y45，由云南省农业科学烟草研究院提供；软腐果胶杆菌（Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum）MY9，由笔者实验室保存；细菌基因组DNA提取试剂盒（BioTeke），购自生工生物工程（上海）股份有限公司；土壤DNA提取试剂盒（美国MO BIO），购自北京宝杰罗生物科技有限公司；PCR引物由宝生物工程（大连）有限公司合成；TaKaRa SYBR Premix Ex Taq（Perfect Real Time）试剂盒，购自宝生物工程 （大连） 有限公司；荧光定量PCR仪器（BIO-Rad IQTM5），由云南农业大学生物多样性国家工程中心提供。 　　云南省文山州5个县（广南县、丘北县、麻栗坡县、马关县、砚山县）的100份土壤样品，由云南省文山州烟草公司协助采集。 　　1.2试验方法 　　1.2.1茄科雷尔氏菌标准菌株DNA提取与检测使用细菌基因组DNA提取试剂盒（B