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喉外伤后声带瘢痕形成机制实验研究 　　[摘要] 目的 通过研究兔声带损伤后不同时期的组织病理学改变、上皮增殖活性及主要细胞外基质（ECM）的变化，探讨声带瘢痕形成机制。 方法 实验用兔声带锐性损伤后1周～6个月，通过HE染色、免疫组化染色、ELISA测定及Masson染色法，观察声带组织学结构变化、上皮增殖活性及固有层内透明质酸、胶原纤维等主要ECM的分布及含量变化。 结果 兔声带损伤后3个月内上皮增殖活性增强；6个月内胶原纤维含量明显高于正常对照组（P 0.05）；透明质酸增加不明显。 结论 兔声带损伤后早、中期各种ECM分泌增加，主要表现为以胶原为主的纤维组织明显增多且呈无序排列，透明质酸增加不明显；在损伤后期胶原持续高于正常，导致声带局部瘢痕形成。 　　[关键词] 声带瘢痕；细胞外基质；组织学 　　[中图分类号] R739.65 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2012）29-0016-03 　　近年来，耳鼻咽喉外伤逐渐增多，声带损伤后瘢痕形成是永久性嗓音障碍的难治原因之一，严重者将出现喉腔粘连、狭窄，甚至引起呼吸困难，将严重影响患者的正常工作、社交和生活，但迄今尚无针对瘢痕本身的有效治疗。这一问题长期以来一直困扰着临床医生和患者。近些年来很多国内外相关研究将目光聚集于声带固有层内细胞外基质（extra cellular matrix，ECM）上，越来越多的研究表明，ECM的有序化排列是维持声带正常振动的基础，是干预声带疤痕形成的希望。声带损伤后ECM的组成和结构改变，纤维组织的大量增生、无序沉积、局部挛缩，影响声带形态、振动及声门闭合，往往引起不可逆的变化[1，2]。我们从2011年1月开始，通过研究兔声带损伤后不同时期的组织病理学改变、上皮增殖活性及主要ECM（胶原纤维、透明质酸）的变化特点，了解声带自身的修复特点，为声带损伤后选择合理的治疗方案提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验动物及分组 　　新西兰白兔25只（上海医科院，普通级），雌雄不限，体重2.5～3.0 kg，采用随机数字表法分为两组，创伤组20只，对照组5只。 　　1.2主要试剂 　　透明质酸（hyaluronic acid，HA）酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（Rapid Bio Lab，美国），小鼠抗大鼠增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）单克隆抗体（Santa Cruz，美国）。 　　1.3主要仪器及设备 　　小号支撑喉镜（Karl Storz Gmb H，德国），喉刀。 　　1.4方法 　　1.4.1喉外伤的兔动物模型的建立[3，4] 手术操作均由同一人完成。创伤组：新西兰兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠1 mL/kg行静脉麻醉后，固定于手术台上，以支撑喉镜暴露声门。用微型喉刀机械切划声带前中部至声韧带，造成声带机械性损伤。左右侧均同法处理。对照组：声带不作创伤处理。 　　1.4.2 术后检测 ①HE染色：术后1周、1个月、3个月、6月，分别在创伤组中随机（采用随机数字表法）抽取5只新西兰兔处死，将喉取出，可获得40份声带标本，术后6个月后处死对照组5只新西兰兔，获得10份声带标本。从手术损伤部位切取1 mm×1 mm×1 mm的声带黏膜组织，于4%甲醛中固定后，清水漂洗，石蜡包埋后切片，片厚4 μm，行苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察。②透明质酸（HA）检测：将各时间点所取50份声带标本中手术损伤部位切取0.1 g的声带黏膜组织（重量由电子天平称得）研磨成组织匀浆。用ELISA测定共计50份样本中的透明质酸（HA）含量。测定具体步骤按试剂盒说明书进行，在酶标仪上读取吸光度（A）值，通过标准曲线换算成相应质量浓度，结果以pg/mg表示。③上皮细胞增殖强度检测：标本切片后采用免疫组化法检测声带黏膜上皮中的PCNA表达。具体步骤：组织石蜡切片，厚4 μm，60℃恒温箱内烤片1 h。二甲苯脱蜡和水化，酒精梯度脱二甲苯，蒸馏水清洗。微波法修复抗原，置于3% H2O2溶液中室温下孵育30 min，以去除内源性过氧化物酶活性。PBS液洗，滴加正常血清封闭液，37℃孵育10 min。滴加一抗PCNA抗体，4℃过夜，PBS清洗。滴加二抗（生物素化羊抗鼠抗体），37℃孵育20 min，PBS清洗。加链霉菌生物素—过氧化物酶溶液，37℃孵育20 min，PBS清洗。DAB显色剂显色，苏木素复染，片烤干，封片，光镜下观察。免疫组化检测结果的观察及判断细胞计数：以细胞核呈弥漫棕黄色细小颗粒为阳性细胞，每张切片上皮层随机取8幅视野，采用全自动图像分析仪对阳性细胞进行计数，在400倍显微镜下记录每视野