第5章 沉淀反应幻灯片.pptVIP

第五章　沉淀反应 (precipitation reaction) 多克隆抗体非常适用于免疫沉淀试验。 单克隆抗体 抗原表面只有一种表位，不易形成交联， 单克隆抗体一般不适用于免疫沉淀试验， 抗原表面有2个以上相同的表位，单克隆抗体也可用于免疫沉淀试验。 R型抗体：沉淀反应中多用。 第一节　液相沉淀试验 （自学） 液相沉淀试验 是指可溶性抗原与抗体在含电解质的液体介质中反应，形成肉眼可见的沉淀物。 经典的液相沉淀试验： 絮状沉淀试验 环状沉淀试验 第二节　凝胶沉淀试验（gel phase precipitation） 原 理 凝胶孔径3nm，抗原或抗体分子（3nm）可在其中自由运动。分子越大，扩散越慢，可据此识别分子量的差异。 当抗原抗体结合形成抗原抗体复合物，分子量在百万以上，则被网络在凝胶中，出现肉眼可见的沉淀物。 凝胶沉淀试验的分类 单向免疫扩散试验 （single immunodiffusion test） 双向免疫扩散试验 （double immunodiffusion test） 一、单向免疫扩散试验 （一）原理 待测抗原溶液在含有相应抗体的凝胶内自由扩散，在二者比例适当处出现白色沉淀环，沉淀环的大小与抗原浓度呈正相关。 用一系列已知浓度的抗原标准品进行试验，绘制标准曲线作为标本中抗原定量的依据。 （二）技术要点 ①用电解质溶液配制10g/L的琼脂糖凝胶，加热溶解后，放56℃水浴平衡温度； ②琼脂糖冷至56℃后，加入一定量的抗体血清，充分混匀； ③倾注琼脂糖板，琼脂糖厚2mm，凝固后打孔，孔径3mm，孔距10～12mm； ④孔内定量加入待测抗原溶液或不同浓度的抗原标准品溶液； ⑤湿盒37℃，24～48h，测量沉淀环的大小。 （三）数据处理 （四）应用与评价 本法为经典抗原定量技术，常用于IgG、IgA、IgM、C3、C4等血浆蛋白的定量测定。 若将一定浓度的抗原加入凝胶中，也可检测抗体浓度，称为逆向免疫扩散试验（reversed immunodiffusion test），其主要用于荧光抗体、酶标抗体和抗血清中抗体蛋白含量的测定。 操作简单，无需特殊设备，重复性和线性均可信。但灵敏度稍差（1.25mg/L），耗时长，影响因素多。 （三）影响因素 1.抗原抗体特异性要强，否则将会出现交叉反应，导致假阳性结果。 2.抗原抗体比例要适当，二者比例适当时，出现一条清晰的纤细的沉淀线。若比例不适当沉淀线将变得宽而模糊，甚至不出现沉淀线，导致假阴性结果。 3.温度低，抗原抗体反应慢；分子越大，扩散速度越慢，时间越长。 4.琼脂板厚度也将影响实验结果。 （四）应用与评价 1.抗原或抗体的定性分析　用已知抗体（或抗原）检测未知抗原（或抗体）。 2.抗体效价测定　在梅花形孔的中央孔放定量抗原，周边孔放不同稀释度的相应抗体，以出现沉淀线的抗体最高稀释倍数为该抗体的效价。 3.抗原或抗体的纯度鉴定 一对相应抗原抗体结合后，只能形成一条沉淀线，若出现多条沉淀线，说明不纯。 4.抗原、抗体的相对分子量和相对浓度的估计 分子量大者，扩散慢，扩散圈小，局部浓度较大，沉淀线弯向分子量大的一方，若二者分子量相当，则成直线； 浓度大，扩散速度快，且需扩散较远的距离被稀释后，才能形成抗原抗体合适比，沉淀线靠近浓度低的一方。 5.抗原性质分析 A:两条沉淀线完全融合，表明抗体与两个抗原中的相同表位结合而沉淀，但这并不意为着两个抗原必定完全相同。 B:沉淀线交叉，表明两个抗原完全不同； C:两条沉淀线相切，表明两个抗原部分相同，二者都有表位1，但其中另一个抗原还含有表位2。 操作简单，无需特殊设备。 特异性高，结果可靠，成本低廉。 灵敏度低，耗时长，不能精确定量。 优点： 1.加快反应的速度。 2.提高了灵敏度。 　　3.增加了分辨率。 　　　 应用与评价 用于抗原或抗体的定性分析、效价测定和纯度鉴定等。 灵敏度比双向免疫扩散试验高8～16倍。 分辨力低于双向免疫扩散试验。 不适宜于抗原为免疫球蛋白的情况，因这会导致电泳时抗原抗体朝一个方向泳动。 应用与评价 用于抗原蛋白定量，如IgA、IgG、IgM和SIgA，C3和C4及其裂解产物，AFP等。 若琼脂中加定量抗原可检测标本中抗体的含量，称为反向火箭免疫电泳（reversed rocket immunoelectrophoresis）。 本法影响因素多，现应用较少。 应 用 ①纯化抗原或抗体的成分分析，粗略检测其纯度。 ②正常和异常体液中蛋白质组成分析，如无丙种球蛋白血症、多发性骨髓瘤等病人的血清蛋白成分分析； ③不同抗体成分的研究，如免疫后抗体组分的动态变化。 四、自动化免疫电泳 1.电泳系统　 2.光密度扫描系统 第四节　免疫浊度测定 应用抗原