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基于SYBR Green检测小麦黄花叶病毒两步法qPCR 　　摘要：小麦黄花叶病毒病是其常发病，常造成严重减产。为建立可用于定量检测小麦黄花叶病毒（WYMV）拷贝数的qPCR方法，本研究对不同来源的WYMV小种序列进行比对分析，在序列保守区域设计引物11对，对其退火温度进行优化，进而建立各引物的qPCR标准曲线。结果发现，11对引物的扩增效率在50.60%～116.04%之间，仅2对引物可用于后续研究，扩增效率分别为97.21%（WY-05和WY-06）和91.85%（WY-F2和WY-R2）。利用其中的WY-F2和WY-R2对高抗和高感WYMV的小麦品种进行分析，结果显示，抗感小麦品种WYMV拷贝数差异极显著。对抗感分离群体266个单株进行分析，发现该qPCR方法灵敏度显著高于酶联免疫吸附剂测定法，更适用于抗感杂交分离群体的表型鉴定，因而可以用于抗WYMV基因的遗传定位与图位克隆工作。 　　关键词：小麦黄花叶病毒；两步法qPCR；酶联免疫吸附剂测定法 　　中图分类号：S435.121.4+9文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）07-0118-07 　　小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic virus，WYMV）是一种由禾谷多黏菌（Polymyxa graminis）介导才能侵染寄主的土传病原微生物，最早在日本发现[1]，后在中国和加拿大等国发现[2，3]。感病小麦表现为根系发育差、植株松散[2]、叶片发黄、生长发育迟缓甚至矮化[2，4]，分蘖力、成穗率和产量降低[2，5]，对小麦品质也有不利影响[6]。我国小麦黄花叶病毒病分布范围广，包括北部冬麦区的胶东沿海副区、黄淮冬麦区大部、长江中下游麦区和西南麦区部分地区等[7]，该病害受寄主感病程度、病毒毒力以及气候因子特别是温度影响较大[5]。近10年来，我国小麦黄花叶病毒病呈逐年加重之势[2]，仅2006年，就有9个省爆发该病，受灾面积达到200万公顷，造成小麦减产15亿千克[8]。 　　WYMV及其载体在土壤中的潜伏期很长。研究显示，有WYMV发病土地，即使10年不种植小麦，10年后仍然对小麦具有较强的致病毒力[9]。所以，一旦某一麦区暴发该病将很难根除，对小麦生产威胁较大。因此，研究清楚抗小麦黄花叶病毒病品种的抗病机制对小麦分子育种具有重要意义，定位并图位克隆抗WYMV基因进而进行基因功能验证是研究抗WYMV机制的基础。基于此，我们开展了抗WYMV基因的精细定位与图位克隆工作（待发表）。而精确鉴定分离群体抗病性则为能否成功精细定位并图位克隆到基因的关键，因此，材料抗病性鉴定方法就成为问题的重要一环。目前，对WYMV的鉴定方法有形态学调查[10]、蛋白水平检测[11，12]和分子水平检测[8，13]等。然而，上述方法均是检测WYMV的定性分析方法，不能定量获得植株感染病毒拷贝数进而对植株抗病程度进行精确界定。为了解决这一问题，本研究拟通过建立一种基于SYBR Green检测WYMV的两步法实时定量PCR（qPCR），并对抗感分离群体进行病毒拷贝数定量分析，确认可应用于WYMV病毒数鉴定的方法。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　高抗WYMV的美国小麦品种Madsen由日本国家研究中心提供。日本小麦品种（系）Hokushin（感WYMV）、TK-2（抗WYMV）和Shinchunaga（未鉴定WYMV抗性）由日本北海道中央农业试验站提供，其中TK-2是Hokushin/Madsen的BC5F4近等基因系。编号为#001～#266的植株为Hokushin/TK-2的F2抗感WYMV分离群体。除Shinchunaga外，其余试验材料全部种植于富含WYMV的日本北海道中央试验农场编号为Minami-Mareppu 40的区域地块里，当年秋季播种，次年4月中旬待植株充分发病后取样进行病毒数检测。所有参试材料均测定来自同一地块不同位点的三个不同单株（取旗叶下的第二叶）的病毒拷贝数，减少因种植过于集中且土壤含病毒不均匀或病毒感染上传不充分造成的误差。除此之外，Madsen、Hokushin和Shinchunaga还被种植于日本国立农业生物资源研究所（筑波）不含WYMV的试验农场中，作为前述种植于含WYMV地块中样品的阴性对照。 　　DNA酶Ⅰ购自TaKaRa公司，RNA纯化及反转录所用试剂耗材、连接载体均购自Invitrogen公司。 qPCR所需试剂购自日本东洋纺公司，48孔反应板及高透光封口膜购自ABI公司。 灭菌DEPC移液枪头和RNase AWAY分别购自QSP和MBP公司，ELASI试剂盒购自WAKO公司。 　　1.2试验方法 　　1.2.1总RNA提取、检测与纯化取200 mg 鲜叶片放于加入氧化锆珠的2 mL