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基于PCR快速检测方法对于植物检疫部门应用研究 　　[摘要]随着我国农林业的持续、稳定、健康的发展，植物检疫技术与此同时也不断地日益更新完善，PCR技术出现后，受到众多科研土作者的重视并在多个领域得到应用。尤其在病原物检测方面，其优越性得到了充分体现。 　　[关键词]PCR 荧光PCR 植物检疫 　　中图分类号：Q37文献标识码：A 文章编号：1671-7597（2008）1210003-01 　　 　　PCR技术的建立和发展已使传统的分子生物学方法发生了革命性的变化，以其强大的生命力迅速渗透到分子生物学的各个领域。不仅实现了对基因组直接测序克隆和文库构建、基因突变检测、寡核苜酸探针合成、抗性基因标记、差异表达筛选以及对基因序列多态性的检测等，而且也广泛地应用于病原物检测和疾病的早期诊断。 　　 　　一、我国植物检疫技术的现状 　　 　　中国是一个农林大国，农林业大发展依赖于优良品种的引进和培育，而优良品种的安全引进和培育，必须建立起适应现代化农业要求的检疫防疫体系，有效防止危险性检疫病虫传播蔓延，促进对外交往和农产品进出口贸易，确保我国农林业持续、稳定、健康发展。特别是改革开放25年来，党和政府十分重视植物检疫工作，检疫机构建立健全，并且检疫队伍不断壮大，检疫法制日益完善，因此，植物检疫在促进农林业发展的同时，自身也得到了长足的发展。 　　我国在有害生物风险分析（PRA）方面工作刚刚起步，在理论体系和技术应用方面有待加强与完善，检疫风险管理意识正在逐步被接受。目前，除少数检疫对象外，对农林植物有害生物种类、分布、危害缺乏系统调查，底码不清，心中无数，哪些是新入境的，哪些是原来就有的更是无记录，对一以前发表的一些错误的或过时的鉴定、分布资料，没有及时更正。而美国、澳大利亚等发达国家非常重视种苗的风险分析，他们对于从未引进过的种苗或疫情不清楚的种苗，必须先进行PRA，再决定是否可以引进，并将种苗按风险大小分类，采取不同的检疫措施，有的禁止引进，有的有条件地引进，有的基本放开，引种检疫管理相对比较科学。 　　 　　二、PCR技术原理及特点 　　 　　PCR的实质是体外酶促扩增特异的DNA片段，又称无细胞分子克隆。PCR过程包括三个基本步骤，首先将靶DNA变性，然后上下游引物退火至变性的ONA链上，再通过耐热DNA聚合酶使引物得以延伸，新合成的DNA链作为后来DNA合成的模板，按上述三个步骤重复30-35次，使目标DNA片段拷贝数呈指数级增长。 　　PCR技术具有以下特点：（l）特异性强。以核酸为靶标，选择性扩增；（2）模板用量少，检测灵敏度高达fg级（DNA）。甚至可以扩增化石、木乃伊及玻泊内极微量的DNA。回时，高的灵敏度也会由于环境污染、样品交叉污染或操作用具污染等引起假阳性，这就需要严格规范操作；（3）快速，无放射性标记。一般在3h内即可完成30次以上的循环扩增；（4）对样品要求低。只要样品中含有靶序列核酸，就可通过PCR扩增出，甚至一些动物细胞和细菌可以不经提取核酸而直接进行扩增；（5）简单易学。一个初学者从模板制备、PCR扩增条件优化到PCR鉴定只需2～3周时间即可掌握。 　　 　　三、PCR技术用于病原物检测的策略 　　 　　一种策略是基于病原物的特异性核酸片段，设计合适的引物进行PCR扩增，根据扩增样品中特异性电泳条带或核酸探针杂交信号有无来判断送检样品是否带有某种病原物。该技术由于操作简便、快速准确，目前应用最为普遍。尤其在检疫性有害生物的检测上，如在柑桔黄龙病菌、柑桔溃疡病菌即、梨火疫病菌、木薯枯萎病菌、小麦印度腥黑穗病菌l、大丽轮枝菌、番茄不孕病毒TAV、烟草环斑病毒TRSV、番茄环斑病毒ToRSV、李坏死环斑病毒PNRSV、松材线虫等检疫性有害生物的检测中，这种策略发挥了重要的作用。该策略中特异性引物的设计常需要了解靶病原物的核酸序列。通常是根据基因组中特异性基因或核酸序列、rDNA及其内转录间隔区（ITS）设计引物。质粒DNA也可作为PCR检测目标，因为质粒DNA的一些片段与病原菌致病性或适生性相关，但质粒稳定性问题一直困扰着这一策略的实用性，常造成漏检现象。利用质粒DNA为目标的PCR检测技术的可靠性和稳定性仍取决质粒本身的特性。 　　 　　四、常规PCR的应用前景及与荧光定量PCR的比较 　　 　　实时荧光定量PCR是国外最近几年发展的一种新的核酸定量技术。该技术结合了荧光检测系统和PCR扩增系统，在PCR扩增过程中通过光电传导系统就能检测模板DNA有无扩增并可获得定量结果，而且简化了检测程序。由于采用了荧光信号放大，其检测灵敏度得到明显提高。实时定量PCR的应用非常广泛。在科研方面，可定量分析各种基因的表达、分析基因突变和多态性、分析细胞因子的表达、单核