根癌农杆菌介导的玉米萌动胚NPR1基因遗传转化.docVIP

根癌农杆菌介导的玉米萌动胚NPR1基因遗传转化 　　摘要：以玉米萌动胚为外植体，研究了影响根癌农杆菌介导的玉米ＮＰＲ１基因遗传转化的若干因素。结果表明，在感染液和共培养基中分别都加入１００ μｍｏｌ／Ｌ乙酰丁香酮，根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４的菌液，浸染时间１２ ｈ，４０ ｍｇ／Ｌ潮霉素进行转化苗筛选，为转化的适宜条件。对转化苗进行ＰＣＲ检测，证明外源目的基因已整合到玉米基因组中。 　　关键词：玉米；根癌农杆菌介导；遗传转化；ＮＰＲ１基因；萌动胚 　　中图分类号：Ｓ５１３；Ｑ７８文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）14－2985-03 　　 　　Genetic Transformation of NPR1 Gene to Germinating Embryo of Maize by Agrobacterium tumefaciens 　　 　　ＱＩＮ Ｘｉｎ－ｍｉｎ，ＺＥＮＧ Ｄｅ－ｌｏｎｇ，ＬＩ Ｈｕｉ－ｍｉｎ，ＱＩＮ Ｐｉｎｇ－ｓｈｅｎｇ 　　（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｕａｎｇｘｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｌｉｎ ５４１００４，Ｇｕａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ） 　　 　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｕｓｉｎｇ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ ｅｍｂｒｙｏ ｏｆ ｍａｉｚｅ ａｓ ｅｘｐｌａｎｔｓ， ｓｅｖｅｒａｌ ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ that ｇｏｏｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｆ ｔｈｅ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｏｆ ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ ｉｎ ｂｏｔｈ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｃｏ－ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ １００ μｍｏｌ／Ｌ； ＯＤ６００ｎｍ ｏｆ ＬＢＡ４４０４ ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ ｌｉｑｕｏｒｗａｓ ０．６； ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｗａｓ １２ ｈ； ａｎｄ ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｏｒ １６ ｈ ａｔ ２６ ℃， ｕｓｅ ４０ ｍｇ／Ｌ ｏｆ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｐｌａｎｔｓ． ＰＣＲ ｔｅｓｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＮＰＲ１ ｇｅｎｅ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｉｎｔｏ ｍａｉｚｅ ｇｅｎｏｍｅ． 　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍａｉｚｅ； Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ； ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ； ＮＰＲ１ ｇｅｎｅ； ｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ ｅｍｂｒｙｏ 　　 　　玉米是世界重要的粮食作物之一，栽培面积仅次于小麦和水稻居第三位，但产量却居世界第一。在玉米栽培过程中病害严重，如大小斑病、青枯病、病毒病、锈病等严重影响玉米的产量和品质。因此，生产上亟需优良抗病的玉米品种。转基因技术是培育抗病、高产、优质品种的有效途径之一。 　　ＮＰＲ１基因是植物系统获得性抗性中的一个关键基因，它可调控植物的广谱性抗性的发生，在植物系统性抗病中起着关键的作用［１］。ＮＰＲ１基因的表达可导致下游抗病基因的一系列反应，从而赋予植株对细菌病原体和真菌病原体的抗性，即使ＮＰＲ１基因过量表达也只是提高了植物的抗病性，并无其他的不良反应［２］。ＮＰＲ１基因功能是通过将克隆的野生型ＮＰＲ１基因转化到拟南芥ＮＰＲ１基因突变体中，恢复了突变体抵抗Ｐseudomonas ｓｙｒｉｎｇａｅ和Ｐhytophthora ｐａｒａｓｉｔｉｃａ的能力［３］来证实的。Ｃｈｅｒｎ等［４］在通过让水稻过量表达拟南芥ＮＰＲ１基因的实验来确定ＮＰＲ１基因在单子叶植物中所扮演的角色时，发现转基因水稻植株表现出对Ｘｏｏ（一种水稻细菌性枯叶病原体）的抗性提高，首次证明了ＮＰＲ１基因可以提高单子叶植物的抗病性。因此，ＮＰＲ１基因作为植物广谱抗病性基因日渐受到人们的关注。 　　利用构建的ＮＰＲ１基因表达载体，采用根癌农杆菌介导方法，以玉米成熟萌动胚为转化受体，建立了根癌农杆菌介导玉米萌动胚的遗传转化体系，获得了转基因植株。经分子检测证明外源ＮＰＲ１抗病基因已整合进转基因玉米的基因组中。 　　１材料与方法 　　１．１材料 　　根癌农杆菌为ＬＢＡ４４０４，所用的植物表达载体为ｐＣａＭＶＮＰＲ（带有ＮＰＲ１基因和选择性标记潮霉素磷酸转移酶基因［５］）。实验材料为玉米自交系７２３９。 　　１．２方法 　　１．２．１种子处理参照王昌涛等人的方法［６］并稍加改进。玉米种子用自来水冲洗干净，将种子浸泡