细胞学一．细胞复苏细胞复苏取一塑料杯盛上适量自来水浴锅.DOCVIP

细胞学 一．细胞复苏 细胞复苏 ? ? ?? （1）取一塑料杯盛上适量自来水浴锅加热至40℃左右，或直接使用37~38℃的水浴。从液氮中取出冻存管立即投入温水中迅速化冻。 ? ? ?? （2）取出冻存管，擦去表面的水，用75℃乙醇清洁管口，打开。 ? ? ?? （3）如果是添加DMS0的冻存液，则需要将DMSO去除。离心去上清收集细胞沉淀，加入无血清培养液洗一次，再次离心去上清。加入3mL含10%牛血清的新鲜培养基，于小培养瓶中培养。如果是添加甘油的冻存液，则不必去除，直接加入2mL含10%牛血清的新鲜培养基，吸入小培养瓶中培养。 ? ? ?? （4）吸取冻存管中剩余的生冻存原液27μL至一次性PE手套上再加入3μL台盼蓝染液，混匀。滴加在细胞计数板上。显微镜下计数细胞，以检查复苏细胞的存活率。活细胞不被台盼蓝染液着色，仍是透明的白色；死细胞的细胞膜破损，台盼蓝进入细胞，细胞呈蓝色。计算其百分比，得到细胞存活率。 ? ? ?? （5）每日观察细胞生长情况，如果死细胞较多，复苏次日应换液。待细胞长满可进行传代培养。 ? 【注意事项】 ? ? ?? （1）在使用含有DMSO的冻存液时，因为DMSO室温状态易损伤细胞，所以在细胞加入冻存液后应尽快放入4℃冰箱中。 ? ? ?? （2）准确记录细胞的种类、冻存的时间、冻存液的品种和冻存者的姓名。 ? ? ?? （3）细胞冻存和复苏的操作容易造成污染，需特别注意无菌操作。 二．细胞培养注意事项 细胞培养注意事项 ? a.实验进行前，先摆好操作台，开启操作台及无菌室紫外灯灭菌30-60min; b.灭菌后关闭无菌室、操作台紫外，并开启日光灯15-20min后打开操作台和无菌室加装滤网的通风系统5-10min以降低臭氧浓度（减少对操作人员的伤害），开始实验。 c. 实验人员必须穿好实验服，戴好口罩及手套后方可进入实验室。这一方面可以减少无菌室的污染，一方面可以保护实验员的安全。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台，并且操作期间切不可弄伤手部及接触感染源的皮肤。 d.实验操作前用75%酒精擦拭工作区域，并应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作,在酒精灯附近操作。 e.实验时避免经过培养皿或试剂瓶上空，小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口。 g.为防止交叉污染，细胞培养液（DMEM、RPMI-1640等）应分装标记使用。一种细胞使用对应瓶分装的培养基。 h.培养基使用前调整温度至37℃。 i.Trypsin、FBS、NBS应分装使用，避免反复冻融。 j.经常检查细胞培养箱内的CO2的浓度、温度、湿度等，查看CO2 钢瓶的内外压力表，定期检查操作台及无菌室的通风过滤系统、紫外杀菌灯等，并注意维护，定期更换。 三．MTT实验前注意事项及贴壁细胞/悬浮细胞实验大汇总 实验前应明确的问题 ? 1. 选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行mtt 试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。 ? 2. 药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记!否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。 ? 3. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了(到了平台期)那个时间点应该就是最好的时间点(因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显)。 ? 4. 培养时间。200ul的培养液对于10的4~5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。 ? 5. MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌 也可以导致MTT比色OD值的升高。 ? 6. 理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。 ? 7. 实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜 。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。 ? 8. 避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在