基于在位光还原银胶法表面增强拉曼散射技术检测核酸碱基.docVIP

基于在位光还原银胶法表面增强拉曼散射技术检测核酸碱基 　　DOI： 10.3724/SP.J.1096.2011.01159 　　 　　1（吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室， 长春130012）2（吉林大学生命科学学院， 长春 130012） 　　3（吉林省长春市疾病预防控制中心， 长春130033）4（长春医学高等专科学校，长春 130013） 　　摘 要 在环状有机物存在的条件下，Ag＋经激光诱导可发生光还原反应，形成Ag原子聚集的银胶体。本研究通过拉曼散射光谱、紫外-可见光谱和扫描电镜证明，核酸碱基和Ag＋混合溶液经过激光诱导可以生成银胶体颗粒。随着银胶体的生成，核酸碱基的拉曼光谱信号因为表面增强拉曼散射效应而得到明显增强。实验表明，本方法不但可以获得高信噪比的拉曼光谱谱图，而且获得的胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤的增强拉曼光谱与Lee-Meisel银胶和银膜表面两种体系下获得的表面增强拉曼光谱具有相似性。同时，腺嘌呤和鸟嘌呤又出现了一些因Ag＋作用而产生的新位移谱带，但是仍然可以作为指征碱基类别的特征峰归属。利用Ag＋光还原的方法在位获得银溶胶增强拉曼光谱信号，具有银胶制备操作简单、峰位特征等优点，在核酸碱基的低浓度在位检测方面具有应用前景。 　　关键词 光还原反应; 银胶体; 表面增强拉曼散射; 碱基检测 　　 　　 2010-11-25收稿；2011-03-16接受 　　本文系国家自然科学基金面向项目（No资助 　　* E-mail: lzq@jlu.edu.cn 　　 　　1 引 言 　　表面增强拉曼散射（SERS）是一种可以高效检测低浓度分子的方法，它不但能检测出单分子层面甚至亚单分子层面的物质，而且还能在分子水平上给出丰富的物质结构信息。该项技术已经被广泛应用于生物化学、环境化学等领域中有机化合物分子的分析与检测［1～5］ 。 　　可以产生表面增强拉曼散射效应的基底有粗糙的金属表面、金属电极及金属溶胶等［5～9］。其中，利用金属溶胶增强分子拉曼信号的方法是在溶液体系下获得分子表面增强拉曼光谱的重要手段［10，11］。制备银胶的常用方法是Lee-Meisel法，在加热的条件下，Ag＋被柠檬酸钠还原成Ag原子，以制备银胶，虽然这种方法制备的银胶稳定性好，表面增强效果明显，但是需要加热及搅拌，制备一次银胶约需90 min，并需要放置一段时间后才能使用［12］。近年来人们发现，在光照或辐射的条件下，由有机物产生的自由基可直接使金属阳离子还原形成金属原子，通过光诱导Ag＋获得Ag单质基底的方法已备受关注。利用在位光还原银胶法对染料和吡啶等有机小分子进行诱导，可获得很好的表面增强效果［13，14］。但是, 由核酸碱基提供自由基还原Ag＋制备银胶基底，并以此获得核酸碱基的表面增强拉曼光谱的研究还未见报道。 　　本研究将AgNO3与核酸碱基混合在一起，利用激光诱导光还原反应制备的银胶增强碱基的拉曼光谱信号，获得了高信噪比的拉曼光谱谱图。在拉曼增强光谱中可以找到它们的特征峰归属, 以指证碱基类别。通过Ag＋直接进行光还原反应，增强碱基拉曼光谱信号，这种在位光还原银胶法操作非常简单，将成为一种具有潜在应用价值的检测技术。 　　2 实验部分 　　2.1 碱基溶液及AgNO3溶液的制备 　　核酸碱基（腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶）购自Sigma-Aldrich公司，AgNO3购自Sigma公司。分别将过量的碱基溶于5 mL水中，将获得的饱和溶液稀释至260 nm处的吸收值在0.5～1之间，然后根据各自的吸光系数计算碱基饱和溶液的浓度，最后将碱基的浓度稀释至0.1 mmol/L，由于鸟嘌呤在水中溶解度较低, 所以稀释至0.01 mmol/L。 　　将0.85 g AgNO3溶解于5 mL水中, 得1 mol/L AgNO3溶液，梯度稀释配制成0.1, 0.01和0.001 mol/L AgNO3溶液。 　　实验用水均经过 Millipore 公司的净化系统处理，电阻值大于18 MΩ?cm。 　　2.2 Lee-Meisel银胶溶液的制备 　　根据Lee-Meisel方法，利用柠檬酸钠还原AgNO3，制备银胶溶液。将90 mg AgNO3溶解于500 mL水中，并加热至沸，将10 mL 1% 柠檬酸钠溶液缓慢滴入AgNO3溶液，保持溶液体系为微沸的状态，持续剧烈搅拌，加热约90 min取出，将获得的银胶溶液低温避光保存备用［12］ 。 　　2.3 银膜的制备 　　采用电子蒸镀机将银蒸镀在10 cm × 5 cm的玻璃片上，将获得的银膜低温避光保存备用。 　　2.4 拉曼光谱测量 　　2.4.1 在位制备银胶体系下的拉曼光谱测量 将0.1