大丽轮枝菌V991b及其变异体培养性状及致病力研究.docVIP

大丽轮枝菌V991b及其变异体培养性状及致病力研究 　　摘要：以大丽轮枝菌（Verticillium dahilae）V991b和V991w为研究对象，研究其在PDA培养基上的培养性状、温度对其生长发育的影响及其对棉苗的致病力。结果表明，两种病原菌的生长曲线基本呈线性关系。25 ℃下，V991b和V991w菌株在PDA培养基上培养16 d后菌落直径之间差异不显著，且在培养过程中二者之间的生长速率差异不显著。培养温度会影响病原菌表型的变化，30 ℃下V991b中微菌核数量明显减少，培养性状逐步接近于V991w，而V991w形态上不发生变化，PDA培养基中培养16 d V991b和V991w菌落生长直径有显著性差异。35 ℃下，V991b不生长，V991w菌落呈膜状，生长形态类似酵母菌。V991w对高温的耐受显著强于V991b。温度对V991b微菌核的产生有明显影响，35 ℃以上的高温与5 ℃以下的低温都不利于微菌核的产生。查氏液体培养基摇菌后接种棉苗，接种25 d后，两种病原菌的致病力差异显著，分别为48.869和21.777。 　　关键词：大丽轮枝菌（Verticillium dahilae）；培养性状；致病力；变异体 　　中图分类号：S432.4+4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）24-4777-05 　　大丽轮枝菌（Verticillium dahilae Kleb.）是一种土传性的病原菌，在世界范围内对多种大田作物、蔬菜、水果、紫荆和榆树等园林植物都造成不同程度的危害，并且还在逐年扩大[1]。大丽轮枝菌的变异程度高，微菌核的抗逆性强，存活时间长，一旦定殖下来就很难清除。由于大丽轮枝菌的变异性强，在与寄主协同进化的过程中常发生生理分化，产生新的致病类型或生理小种，这种变异性为棉花抗病品种的选育和对黄萎病的防治都造成了极大的困难。抗病品种的缺乏、肥料的滥用导致土壤中微生物生态失衡、气候环境的变化等多方面的影响，使它上升成了棉花上的一种主要病害，轻则导致棉花减产，严重情况下会导致大面积的棉田绝收[2，3]。对大丽轮枝菌的研究多集中在对于同一地区或者不同地区的致病型分化和致病力鉴定上，不同地区病原菌之间的致病力差异非常显著，同一棉田中病原菌的致病力也有较大差别[4]，甚至同一病株上分离得到的病原菌致病力之间也存在较大差异[5]。因为病原菌在遗传背景上有较大差异，各地分离得到的单株之间并无可比性。湖北省农业科学院植保土肥研究所棉病实验室在继代过程中从大丽轮枝菌菌株V991中得到一株突变菌株V991w，对突变株经过多次继代培养后，发现其表现为菌丝型，气生菌丝茂盛，且其性状可稳定遗传。经查氏培养基培养产孢后接种，其致病力明显弱于V991，经过rDNA-ITS分子鉴定表明突变株和对照菌株的DNA序列完全相同，但在PDA培养基中二者的生物学特性及致病力完全不同。本研究希望在同一遗传背景条件下，从菌株的基本生物学特性入手，以野生型V991b及其突?株V991w为研究对象，调查其生物学性状和致病力，以期找到影响病原菌表型和可能与致病力相关的因子，为深入研究病原菌的致病机理提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 供试菌株 野生型V991b为菌核型菌株，由华中农业大学作物遗传改良育种国家重点实验室惠赠；V991w为湖北省农业科学院植保土肥研究所棉病实验室在PDA培养条件下从V991b菌落中分离得到的突变体，为菌丝型菌株，每2周继代一次，用5 mm打孔器于菌落外缘生长旺盛的区域打取菌饼，其性状经过多次继代后可稳定遗传。将V991w保种到PDA斜面后置于4 ℃保种，再接种到25 ℃ PDA培养基中，仍表现为菌丝型菌株。 　　1.1.2 鉴别寄主及种植情况 鉴别寄主有冀棉11、豫棉2067、鲁棉28，均为常规棉。冀棉11为感病品种，豫棉2067为耐病品种，鲁棉28属于抗病品种。采用无土基质育苗，使室温保持在22～28 ℃，棉花种子经硫酸脱绒和双氧水表面消毒后，置于平皿中以无菌水浸泡2～4 h。种子泡好后，分行播种，播种到浸润均匀的基质中，保持湿度，保证温室自然通风，勤加管理。待棉苗长到2～3片真叶时采用裸苗伤根法接种病原菌。 　　1.2 方法 　　1.2.1 培养基 供试培养基为PDA培养基，其制作参照文献[6]，去皮马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂 15 g，去离子水1 000 mL。将去皮的马铃薯切碎，加水煮沸30 min，用纱布滤去马铃薯，加水补足1 000 mL，加糖和琼脂，加热使琼脂完全熔化，趁热用纱布过滤，分装至锥形瓶中，121 ℃灭菌20 min。 　　1.2.2 PDA培养基培养病原菌的形态结构及菌落形态的观察 将V991b和V991w用打孔器取菌落外缘