western-blot与蛋白质双向电泳原理,方法与应用.pptxVIP

western blot与蛋白质双向电泳的原理，方法及应用;western blot原理及方法;第;一.基本原理;二.具体的方法和步骤;I .蛋白质样品制备;II.SDS—PAGE电泳;III .转膜;IV .封闭;V .杂交;VI.显色 ;第;实验原理;等电聚焦电泳;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳;实验方法与步骤;样品制备;IPG胶条上样与第一向等点聚焦;IPG胶条平衡;第二向SDS;胶条染色;硝酸银染色;图像处理分析流程;第;01;由于许多过敏原是来着生物体的机体，尤其表现在蛋白质上。 例如鱼类。鱼类是最常见的易引起过敏反应的食物，而小清蛋白是最常见的过敏原。在建立鱼小清蛋白检测及方法建立过程中利用western blot法完成免疫鉴定，为低免疫产品研制生产提供理论依据。;利用western blot法进行寄生虫病检测一般从寄生虫特异抗原入手，检测人体液内相关蛋白的含量，以确定是否感染寄生虫病。 优点是特异性强，始于用于疑似病人的诊断，但是由于费用高昂，费??且技术要求高所以建议做推广但不建议普及。一般检测常用ELISA检测。 应用病例： 诊断囊虫病：运用DN A重组技术,构建来源于猪囊尾蚴的cDNA表达文库,以囊虫病患者血清及病猪血清为抗体,从中筛选出4个特异性抗原（cC1、cC2、cP1、cH1）,这些抗原克隆经IPTG诱导,形成β-半乳糖苷酶-猪囊尾蚴特异性抗原的融合蛋白( fusion protein, FP)。 诊断人颚口线虫病：采用Western印迹技术检测颚口线虫特异的相对分子质量为21 000和24 000抗原蛋白条带，结果 Western印迹法检测颚口线虫患者血清,均可见相对分子质量为24 000的条带,7份可见相对分子质量为21 000的条带。;利用western blot检测基因产物的表达水平一般应用于肿瘤，糖尿病的由于机体自身病变的疾病诊断中。 应用病例： 成人隐匿型糖尿病：通过免疫印迹四联检测试剂条对319例2型糖尿病患者进行糖尿病自身抗体[谷氨酸脱羧酶抗体（GAD）、胰岛细胞抗体（ICA）、胰岛素抗体（IAA）、酪氨酸磷酸化酶自身抗体（IA‐2）]检测，显著高于单一抗体检测。结论检测血清GAD、IA‐2、IAA、ICA能够为LADA的早期诊断提供依据，同时更好地进行病情评估和治疗方案的调整。 胃癌诊断：采用免疫印迹检测NOTUM蛋白及β-catenin蛋白的表达量,使用SPSS进行相关性分析确定NOTUM蛋白与β-catenin蛋白之间的关系，确定胃癌发展情况。;检测病毒感染有两个应用方向：疾病诊断与血液筛选。 疾病诊断例：风疹病毒(ＲＶ) 能够引起先天感染。通过孕妇传播,致使胎儿先天畸形或导致先天性风疹综合征如先天性心脏病、智力低下等。因此能够早期快速诊断对于优生优育、提高人口素质 、预防后天及再感染具有重要意义。目前临床上所用的ELISA 检测试剂盒所包被抗原为全细胞粗制抗原 , 特异度低、灵敏度差,缺乏统一的抗原标准。现可采用Western-blot的方法,测定风疹病毒的主要抗原性蛋白, 以指导临床应用 。 ;01;双向电泳技术(2-DE)在蛋白质组学中发挥着重要的作用,可用于研究样品总蛋白、不同样品蛋白质表达差异、蛋白质间相互作用、蛋白质修饰等。 ;1双向电泳技术在病原微生物蛋白质组研究中的进展;;双向电泳技术在病原微生物药物抗性基因功能研究中的应用 双向电泳技术可以进行微生物抗性机理的研究。 Diffes等对Divercin V4l抗性和野生型的产单核细胞 李斯特氏菌进行2-DE分析，发现至少在17个蛋白质存在差异，抗性菌株中缺乏野生型菌株中的9个蛋白质，而新增8个蛋白质，其中只有1个Rl是存在于已知该菌的数据库中，为鞭毛蛋白；机会致病真菌如念珠菌属产生了许多的耐药菌株。 伊曲康唑类化合物通过抑制真菌细胞壁的d-葡萄糖的合成而起作用，而且对耐真菌药物的菌株起作用。Bruneau等对比mulundocandin、氟康唑和伊曲康唑3种杀真菌药处理所产生的白色念珠菌双向电泳差异蛋白质图谱后认为，氟康唑和伊曲康唑在蛋白质组水平具有共同的作用机制。 因此，病原微生物的耐药菌株和敏感菌株的双向电泳研究，对阐明耐药相关机制、鉴定新的药物靶位和耐药诊断标志有非常重要的价值。 ;人们通过双向电泳技术分离正常组织细胞与肿瘤之间的差异蛋白质组分，在寻找肿瘤的特异标志物、揭示肿瘤的发病机制以及开发新的肿瘤治疗方式和治疗药物提供理论依据等方面都取得了一些重要的进展。肿瘤发生的早期常常无任何症状，而只有在转移时才容易被发现，这往往导致延误了治疗的最佳时期。因此找到肿瘤早期的标志物进行及时的诊断和治疗显得尤为重要。;双向电泳技术的出现，为动态、高通量的研究药物作用机制提供了强有力的方法支持。 双向电泳技术的另一应