第二十章高液相色谱20110512.pptVIP

第二十章 高效液相色谱 §20-1 概述 §20-2 高效液相色谱仪 §20-3 液固色谱法 §20-4 液液色谱法 §20-5 化学键合相色谱法 §20-6 离子交换色谱法 §20-7 排阻色谱法 §20-8 色谱分离方法的选择 导 学 以色谱法导论和气相色谱法两章为基础，通过学习，掌握分离原理及分类，了解液相色谱和气相色谱的异同，对高效液相色谱仪的流程了解的前提下，注意梯度洗脱装置；对本章中提及的几种液相色谱法，应侧重掌握其原理和其固定相及流动相的要求，主要是化学键合相色谱法，而对“色谱分离方法的选择”，是对P445的表进行理解。 §20-1 概述 一、高效液相色谱法 二、液相色谱分离原理及分类 高压液相色谱法 在液相色谱普及之前，纸色谱法、气相色谱法和薄层色谱法是色谱分析法的主流。到了20世纪60年代后期，将已经发展得比较成熟的气相色谱的理论与技术应用到液相色谱上来，使液相色谱得到了迅速的发展。特别是填料制备技术、检测技术和高压输液泵性能的不断改进，使液相色谱分析实现了高效化和高速化。这种分离效率高、分析速度快的液相色谱就被称为高效液相色谱法，也称高压液相色谱法或高速液相色谱法。 分离原理 §20-2 高效液相色谱仪 高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统等五大部分组成。 一、高压输液系统 高压输液系统由溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置和压力表等组成。 1、溶剂贮存器 2、高压输液泵 3、梯度洗脱装置 输液泵 ?　　高压输液泵是液相色谱仪的关键部件，其作用是将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。对于带在线脱气装置的色谱仪，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。 . 　　对输液泵的基本要求 流量准确可调。流动相的流速在0.5-2mL/min，输液泵的最大流量一般为5-10mL/min。输液泵的流量控制精度通常要求小于±0.5%。 耐高压。高效液相色谱柱是将很细颗粒（3-10um粒径）的填料，在高压下填充到柱管中，为了保证流动相以足够大的流速通过色谱柱，需要足够高的柱前压。通常要求泵的输出压力达到30-60MPa的高压。 液流稳定。输液泵输出的液流应无脉动。 泵的死体积小。为了快速更换溶剂和适于梯度洗脱，泵的死体积通常要求小于0.5mL。泵的结构材料应耐化学腐蚀。 输液泵 　　输液泵按输出液恒定的因素分恒压泵和恒流泵。对液相色谱分析来说，输液泵的流量稳定性更为重要，这是因为流速的变化会引起溶质的保留值的变化，而保留值是色谱定性的主要依据之一。因此，恒流泵的应用更广泛。　　输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两大类。机械泵中又有螺旋传动注射泵、单活塞往复泵、双活塞往复泵和往复式隔膜泵。 脱气装置 　　流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。气泡一旦进入色谱柱，排出这些气泡则很费时间。在荧光检测中,溶解氧还会使荧光淬灭。溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液pH值发生变化。　目前，液相色谱流动相脱气使用较多的是离线超声波振荡脱气、在线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气。 梯度洗脱装置 为什么要进行梯度洗脱？　　在进行多成分的复杂样品的分离时，经常会碰到前面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度太大，且出峰很晚和峰型较差。为了使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离，往往要用到梯度洗脱技术。 梯度洗脱操作 　线性梯度： 在某一段时间内连续而均匀增加流动相强度。阶梯梯度： 直接从某一低强度的流动相改变为另一较高强度的流动相。　　梯度洗脱时，流动相的输送就是要将几种组成的溶液混合后送到分离系统，因此，梯度洗脱装置就是解决溶液的混合问题，其主要部件除高压泵外，还有混合器和梯度程序控制器。根据溶液混合的方式可以将梯度洗脱分为高压梯度和低压梯度。 (2) 梯度淋洗装置 二、进样系统 进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。液相色谱的进样方式有两种。进样器：微量注射器和进样阀。　　进样器要求密封性好，死体积小，重复性好，进样时引起色谱系统的压力和流量波动要很小。现在的液相色谱仪所采用的手动进样器几乎都是耐高压、重复性好和操作方便的六通阀进样器。 分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等