细胞死亡判--讲课用第四节.pptVIP

细胞死亡判定 中南大学生物科学与技术学院 李杰 jlee@mail.csu.edu.cn 提 纲 细胞死亡判定意义 细胞死亡定义及判定方法 细胞死亡判定方法中存在的问题 细胞死亡判定方法使用—兼谈人体死亡判定 一 细胞死亡判定意义 种子筛选 发 酵 抗癌药物筛选 二 细胞死亡定义及判定方法 细胞死亡的定义 细胞因受严重损伤而累及胞核时，呈现代谢停止、结构破坏和功能丧失等不可逆性变化，此即细胞死亡 呼吸- 代谢- 繁殖 平板计数法 克隆形成实验clonogenic assay MPN most probable number 屏障作用 2.1 细胞膜完整性 显微镜观察？ 电子显微镜？ 染料类别 常见膜完整性检测用染料 传统可见染料：甲基蓝、Evan’s Blue、 Neutral Red 传统可见染料的不足 EB FDA 流式细胞仪应用 流式细胞仪的优点 准确 快速：一般分选速度＞1000个/秒 大量 多参数同时分析（形状，尺寸大小，荧光颜色及强度） PI Annexin V-FITC分析细胞凋亡 2.2 细胞膜电位 测定细胞膜电位染料 3. 能量相关 ATP测定方法 ATP ATP法特点 敏感性高：可检测最少20个细胞 适用范围较广：可对实体瘤、胸腹水、血液等多种肿瘤标本进行体外药敏检测 时间短： 30-60分钟内 Tetrazolium 家族 四氮唑化合物 MTS 还原产物具溶解性 3.3 pH 梯度 检测染料 pH and Health 4. 酯酶 荧光素二乙酯 （Fluorescein Diacetate， FDA ） 5.分子生物学技术 DNA等分子在死亡细胞中比活细胞中更快降解 长序列监测技术比短序列监测更能反映生命力 检测对象 DNA rRNA mRNA 检测方法：DNA probe 检测方法：PCR PCR扩增方法 RT-PCR NASBA(nucleic acid sequence-based amplification,依赖性核酸序列的扩增 ) RT-SDA(reverse transcriptase-strand displacement Amplification,链替代扩增 ) 细胞死亡判定方法总结 现有方法存在的相关问题1 膜完整性测试：染上颜色的细胞一定是死亡细胞？ MTT, FDA：没有染上颜色的细胞一定是死细胞？ 膜完整性测试 活性染料阴性细胞能否再存活？ 问题2 ：活性染料越深生命力越强？ Resveratrol 白藜芦醇 白藜芦醇的功效 天然的抗氧化剂 白藜芦醇的抗白血病作用 白藜芦醇处理细胞MTT还原活性 白藜芦醇处理细胞MTT还原活性 生长抑制细胞MTT还原活性上升原因探讨 问题3：FDA 染色中存在的问题 Energy-dependent, Carrier-Mediated extrusion ■ DES ▲DCCD ● none 缓冲液等对荧光强度的影响 培养基组成对荧光强度的影响 荧光影响因子 以后的科研工作中该如何使用？ 心肺死亡概念 脑死亡判定 全脑死亡：循环和呼吸功能的不可逆终止，或包括脑干在内的全脑功能不可逆终止 脑干死亡：为意识和认知功能的丧失是脑干上行网状结构受到破坏，必将导致患者全脑功能的丧失而死亡。 高级脑死亡：把意识功能的丧失作为诊断的关键 脑死亡男子器官即将移植时苏醒 Four months after he was declared brain dead and doctors were about to remove his organs for transplant, Zach Dunlap is on the road to recovery 脑死亡与器官移植 谢 谢 从什么是生命的角度而言，低等生物生命要素 为：呼吸- 代谢- 繁殖，但三者不一定同时存在。病毒为一种含 DNA或RNA 的蛋白质颗粒,不太符合以上标准；细菌和真菌在不 利条件下可失去以上生命特征，成静息状态（芽孢、孢子形式），这 都不等于死亡。然而，按照“呼吸- 代谢- 繁殖”三大要素标准，非 人类动物的自然死亡便很容易判定 四 细胞死亡判定方法使用 —兼谈人体死亡判定 离奇！ 肝移植 白血病 尿毒症 1万 100万 3万 400万 0.5万 150万 获得器官移植 患者 谢谢！ carboxyfluorescein (cF), BCECF, pyranine cSNARF-1 Keer Birch, 2003 三 细胞死亡判定方法 中存在的问题 Caron et al., 1998 蒽醌萜类化合物 蓼科植物虎杖 葡萄酒中的抗癌明星 法兰西奇迹 具有神奇抗癌效能的白藜芦醇