Strobilurin类杀菌剂醚菌酯和肟菌酯的作用机制、检测方法分析及其在柑橘中的残留规律-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

致 谢 三年硕士研究生的学习和生活使我获益良多。在此，我首先要感谢导师戴贤 君教授。在我攻读硕士学位期间，戴老师对我的关心照顾和悉心指导我将铭记于 心。戴老师渊博的学识，严谨的学术态度给我树立了良好的榜样。 本论文是在中国计量学院天问科技楼食品安全研究所完成的。实验的顺利完 成离不开研究所提供的良好的实验条件，更离不开所里的老师对我的帮助。在此 我要特别感谢潘家荣教授、刘明启副教授在实验和论文写作上对我的指导和帮 助。 另外我还要感谢同学金晖、郑文瑾、邹晓楠、李庆超，师弟雷鸣、师妹陈萍、 郑敏对我实验上的帮助。 最后，谨向百忙之中抽出宝贵时间对本论文进行评阅的各位专家教授表示感 谢和敬意。 朱洁 2013 年 6 月 Strobilurin 类杀菌剂醚菌酯和肟菌酯的作用机制、检测方法研究 及其在柑橘中的残留规律 摘要：柑橘采后经常因真菌感染而造成较大的经济损失，利用杀菌剂控制真菌 病害是一种有效的途径。醚菌酯和肟菌酯属新型 Strobilurin 类杀菌剂，具有安 全、广谱、高效的特点，可有效防治柑橘采后的真菌病害，但相关作用机制及 其在柑橘中的残留检测研究报道较少。本论文针对醚菌酯和肟菌酯应用的生产 实践需求,开展醚菌酯和肟菌酯的作用机制、残留检测方法及其在柑橘中降解规 律研究，以促进柑橘及其制品的食用安全。主要研究结果如下： 1.醚菌酯 和肟菌 酯对 三种病原 真菌的 作用 效果及机 制 选用柑橘青霉、绿霉、炭疽菌进行体外培养，当培养基中分别含有两种杀 菌剂时，醚菌酯和肟菌酯对三种病原真菌的半最大效应浓度（EC50）分别为 13.22，66.92，273.74 μg/mL 和 0.18，0.32，1.37 μg/mL。将三种真菌于 EC50 浓度水平的含醚菌酯和肟菌酯培养基中培养，菌丝蛋白含量为检测目标,青霉菌 和绿霉菌可溶性蛋白含量分别从 3h 和 1h 后降低并持续至 24h，炭疽菌可溶性蛋 白含量从开始下降到再次上升只维持了 3h,此后则逐渐升高；当培养基中同时含 有旁路氧化酶抑制剂 SHAM 时,醚菌酯和肟菌酯抑制三种病原真菌的 EC50 浓度 水平明显下降，各菌丝体可溶性蛋白总水平也明显降低。结果表明，醚菌酯和 肟菌酯能较好地抑制三种病原真菌生长,SHAM 与两种杀菌剂均有协同作用效 果。 采用差速离心法获得真菌线粒体，分别研究 0.2-200μg/mL 的醚菌酯和肟菌 酯对真菌线粒体内膜上四种酶复合体活性的影响。结果表明，两者对复合体的 活性影响趋同，四种复合体活性的抑制率与药剂浓度成正相关，但各处理浓度 下的复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ受抑制程度均不如复合体Ⅲ；相同浓度处理下，醚菌酯 和肟菌酯对青霉菌和绿霉菌中的复合体Ⅲ抑制程度较炭疽菌的大。醚菌酯和肟 菌酯可通过影响线粒体呼吸链酶复合体活性而抑制真菌的生长。 .醚菌酯和肟菌酯 QuEchERS-HPLC 同步检测方法的建立 以 AOAC 认可的 QuEchERS 法为基础，样品采用含 1%乙酸的乙腈溶液， 通过优化吸附剂确定采用 PSA:C18(4:1/m:m)作为最佳前处理条件。同步检测采 I PAGE PAGE VI III III 用 210 nm 的波长，甲醇:水（80:20）为流动相洗脱，醚菌酯和肟菌酯的保留时 间分别为 9.3 min 和 12.3 min。当加标浓度为 1.0，0.5，0.05 mg/kg 时，橘肉和 橘皮中醚菌酯的平均回收率约为 83.93%~95.50%和 80.08%~93.77%，相对标准 偏差 RSD%分别为 1.55%~4.50%和 1.80%~4.24%；肟菌酯的平均回收率约为 80.84%~93.47%和 80.00%~91.00%，相对标准偏差 RSD%分别为 3.00%~4.20%， 1.40%~5.20%。醚菌酯和肟菌酯的最低检出浓度分别为 0.005 和 0.008 mg/kg， 符合农残分析的国际标准要求。 .醚菌酯和肟菌酯 ELISA 检测方法的建立 1）将含醚菌酯和肟菌酯共有活性基团的(E)-2(2-溴甲基苯基)-2-甲氧亚氨 基乙酸甲酯（OEBr）与巯基丙酸反应获得羧基，以其为连接臂，采用活化酯法、 混合酸酐法分别制备免疫原和包被原，反应产物分别利用紫外吸收扫描与结合 比的测定、红外、质谱、核磁、SDS方法进行鉴定表明，免疫原和包被 原合成成功，其中免疫原的结合比为 12.8:1，达到动物免疫的要求。 2）免疫原与弗氏佐剂充分乳化制备疫苗，采用多点皮下、腿部肌肉免疫 3 只新西兰大白兔，为期 3 个月。当 3 只兔子的抗血清效价分别为 64000，32000， 32000 且不再上升时，采用效价最高的抗血清进行下一步实验。 3）以包被原 Hapten-OVA 和获得的最高效价抗体(Ab)建立 IC-E