zkscan3基因敲除小鼠模型的研究和EGFR分子转磷酸化机理的研究-生物化学与分子生物学专业论文.docx

zks zkscan3 基因敲除小鼠模型的研究和 EGFR 分子转磷酸化机理的研究 中文摘要 PAGE PAGE VII PAGE PAGE IV 第一部分 zkscan3 基因敲除小鼠模型的建立以及 zkscan3 基因功能的初步研究 中文摘要 目的 ZKSCAN3（人源）是一个新发现的转录因子，前期研究发现该基因在结肠癌 的形成过程中起着一定的作用，ZKSCAN3 在侵袭性结肠癌细胞和其肝脏转移病灶 中过度表达，但在邻近的非转化组织中表达程度很低，但是,至今为止还没有系统 的 ZKSCAN3 基因正常生理功能研究的报告，鉴于其在自噬、肿瘤病理生物学中 的重要作用，通过 zkscan3（鼠源）基因敲除小鼠模型来确定其正常的生理功能就 具有十分重要的意义。 方法 1.通过 CRE 杂交系统敲除野生型小鼠的 zkscan3 基因的 2 号外显子，并对敲除 小鼠的后代做基因型鉴定。 2.采用 RT-PCR 方法半定量 zkscan3 基因在野生型小鼠各个器官的表达情况， 为进一步研究做好前期准备。 3.定量 PCR，使用定量 PCR 进一步对 zkscan3 的敲除结果进行验证，同时使 用定量精确分析 zkscan3 在小鼠胚胎成纤维细胞以及成年小鼠各个器官中的表达 情况。 .使用流式细胞分析技术分析成年野生型小鼠和 zkscan3 敲除小鼠胸腺 CD3+ 细胞及脾脏中 CD3+、CD4+、CD8+细胞百分比含量的差别。 .分别用 zkscan3 敲除小鼠和野生型小鼠的 CDNA 进行 Microarray 分析，找 出与 zkscan3 功能相关的基因。 6.对小鼠进行人工抗原卡介苗刺激，检测小鼠体内免疫应答曲线，并检测小鼠 中文摘要 zkscan3 基因敲除小鼠模型的研究和 EGFR 分子转磷酸化机理的研究 血液指标。 结果 .对杂交新生小鼠的基因鉴定结果显示，zkscan3 基因的 2 号外显子确实被敲 除。 .对小鼠各个器官进行 RT-PCR 结果显示，zkscan3 在小鼠不同器官中表达存 在明显差异，尤其在卵巢、睾丸以及胸腺中高表达。 3.定量 PCR 结果显示，zkscan3 基因 2 号外显子确实被敲除；而且 zkscan3 基 因在野生型小鼠的不同器官中存在差异性表达，尤其在胃、卵巢、脾脏、前列腺 和脾脏中高表达。 4.流式细胞分析发现，敲除小鼠胸腺中 CD3+淋巴细胞数量上比在野生型小鼠 中有显著的升高；同时在脾脏中,CD4+淋巴细胞和 CD8+淋巴细胞的细胞数量也比 在野生型有显著升高。 5.Microarray 结果显示，敲除 zkscan3 后，表达发生显著变化的基因主要集中 在神经系统、免疫系统以及生殖系统。 6.对小鼠进行抗原免疫刺激后，发现与野生型小鼠相比，zkscan3 基因敲除小 鼠的免疫应答出现紊乱，血液检测指数显示，zkscan3 基因敲除小鼠小鼠可能出现 贫血症状。 结论 初步研究结果显示，zkscan3 基因在小鼠体内可能是一个复杂的调控基因，根 据已有数据推断，zkscan3 很可能对免疫系统起到抑制的作用，在小鼠体内我们发 现，它的敲除会导致小鼠免疫功能的上升，并且会造成免疫系统对外来抗原刺激 的免疫应答紊乱，同时也会对神经系统以及生殖系统产生影响。 关键词 小鼠模型；zkscan3；淋巴细胞；Microarray 第二部分 表皮生长因子受体 Y845 位的转磷酸化对其 自磷酸化以及激酶活性的研究 zks zkscan3 基因敲除小鼠模型的研究和 EGFR 分子转磷酸化机理的研究 中文摘要 Abstrac Abstract Part I. zkscan3 knockout mouse model and preliminary study of zkscan3 gene function PAGE PAGE V PAGE PAGE VI 中文摘要 目的 表皮生长因子受体（EGFR），一个众所周知的致癌蛋白，在细胞生长、细胞 周期和许多癌症疾病中起着重要的作用。虽然表皮生长因子受体的二聚化被认为 是表皮生长因子受体激活的一个主要途径，但是有关表皮生长因子受体被激活之 后，表皮生长因子受体之间如何相互作用进行转磷酸化以及自身磷酸化仍然不为 所知。所以进一步研究 EGFR 在 Y845 位转磷酸化作用以及其自身磷酸化激酶活性 将为 EGFR 活化及功能调节机制提供新的见解。 方法 1. 免疫沉淀和免疫印迹 2. 体外激酶实验 3.体外转磷酸化实验 4.转染并稳定表达 EGFR 细胞株的建立 5.细胞生长实验 6.体外 DNA 掺入实验 结果 EGFR 分子 845 位的酪氨酸转磷酸化会影响其自身自磷酸化。 EGFR 分子 845 位的酪氨酸突变后，转磷酸化作用缺