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沙门氏菌invA基因ICAN快速检测法研究 　　摘要：嵌合引物介导的恒温扩增（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids，ICAN）反应需要三个特殊的组成：5-DNA-RNA-3的嵌合引物、耐热的RNaseH及具有链取代活性的DNA聚合酶，此法只需在55℃左右恒温反应一个小时即可[1]。本文阐述了为建立快速检测沙门氏菌invA基因的ICAN法进行的研究，结果没有出现如报道中描述的清晰的三条带，但是与阴性和其他肠杆菌科细菌相比，沙门菌有明显的特异性条带。本文对出现此结果的原因进行了比较详尽的分析。 　　关键词：沙门氏菌；ICAN；invA基因 　　沙门氏菌（Salmonella）为肠杆菌科沙门氏菌属成员，是一类条件性细胞内寄生的革兰氏阴性肠杆菌。绝大多数沙门氏菌对人和动物有致病性，能引起人和动物多种不同的临床表现，主要引起发热、胃肠炎、腹泻和败血症等，中毒严重的，可引起死亡，病死率一般是0.5%～1%[2，3]。据世界卫生组织的报道，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首，给各国经济造成重大损失。因而，在医学和公共卫生上具有非常重要的意义。目前，对沙门氏菌检测大多采用细菌分离、生化鉴定、PCR等方法，过程烦琐、费时费力，并且肠杆菌科细菌间的生化反应多有交叉，因此，这些检测方法在快速、敏感与特异性等方面有自身的局限性[4～6]。Cocolin等[7]利用PCR扩增invA 基因快速检测食品中的沙门氏菌；Bohaychuk[8]等人利用荧光定量PCR技术对沙门氏菌invA基因进行定量检测。随着对分子生物学技术研究的不断进展，2007年日本学者Hiroyuki Mukai[1]等发明了一种嵌合引物介导的恒温扩增法（即ICAN法）。ICAN反应在恒温条件下进行，5-DNA-RNA-3的嵌合引物、耐热的RNaseH及具有链取代活性的DNA聚合酶是ICAN反应必需的。该反应的原理包括多引物反应和模板转换两个机理， RNaseH在新合成链的引物部分的RNA处引入切口后，马上就会在切口处发生链取代反应取代新合成的链，同时，反应液中的嵌合引物立即与模板杂交开始新的延伸反应，多条链同时在同一模板进行的链合成反应称多引物反应机理；模板转换反应是指：原反应液中的模板合成的新模板在RNaseH酶和链取代酶的作用下，可以快速转换出新的模板。由于多引物反应和模板转换反应的同时进行，ICAN比起一般的扩增方法更加快速。ICAN法区别于其他检测方法的最重要的特点是：反应时间短（一般只需60min）、所需模板量少（只需PCR所要求的模板量的1/5）、灵敏度高、扩增反应不需特殊的仪器（普通水浴锅即可），另外，因为ICAN采用恒温扩增系统，所以我们只要简单地增加反应液的体积却不需改变反应条件，这有助于DNA的产业化发展[9]。本文主要对ICAN法应用于沙门氏菌检测的研究情况加以介绍。 　　1 材料与方法 　　1.1菌株 本次试验的菌株全部来自浙江省疾病预防控制中心微生物检验所，名称见表1。 　　1.2主要试剂和仪器 PCR仪（eppendorf Mastercycler Gradient）、离心机（eppendorf centrifuge 5417R）、DU800紫外/可见分光光度计、MiniRun GE-100型凝胶电泳仪、凝胶成像仪（BIO-RAD）、Bca BEST DNA聚合酶（TaKaRa）、Tli RNaseH Ⅱ（TaKaRa）、Hepes（sigma-aldrich）、dNTP Mixture（TaKaRa）。 　　1.3 ICAN引物 由上海生工生物技术委托IDT公司合成（引物序列见下表） 　　1.4菌培养、DNA模板的制备和DNA浓度纯度的测定 　　1.4.1细菌的培养 从半固体培养基中挑取菌落接种于普通琼脂平板上37℃培养18h，再从平板上挑取典型单菌落，用LB肉汤培养液37℃培养过夜。 　　1.4.2 DNA模板的制备 用细菌基因组DNA小量纯化试剂盒（TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0）制备，其步骤为： 　　1.取1～4ml的过夜培养菌液，10000rpm离心2min，弃上清； 　　2.用150μl的SP Buffer（含RNase A1）充分悬浮细菌沉淀； 注：注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器（Vortex）等剧烈振荡使菌体充分悬浮 　　3.加入20μl的Lysozyme溶液，均匀混合后室温静置5min； 　　4.加入30μl的EDTA Buffer，均匀混合后室温静置5min； 　　5.加入200μl的Solution A，剧烈