β-兴奋剂多残留快速检测技术的研究-基础兽医学专业论文.docxVIP

摘 要 β2-兴奋剂（β2 -adrenergic agonist, BAA）属于拟肾上腺素类药物，由于其具有促 进动物生长、提高瘦肉率的作用曾被作为饲料添加剂应用于动物养殖业中。然而 BAA 长期作为饲料添加剂后，它潜在的危害就逐渐被人们认识，会严重危害消费者的身体 健康，因此，建立 BAA 残留检测的方法成为关系食品安全的亟待解决的问题。 本文分别采用混合酸酐法和碳化二亚胺法合成了沙丁胺醇（SAL）免疫抗原和包 被抗原，SAL 与牛血清白蛋白（BSA）的偶联比分别为 12:1 和 6:1，与卵清蛋白（OVA） 的偶联比分别为 9:1 和 4:1。用免疫抗原免疫兔子后，所得抗血清经饱和硫酸铵法沉 淀和 DEAE-纤维素阴离子交换层析纯化，得到纯度较高的抗 SAL 抗体 IgG。该抗体 对 SAL 有较高的特异性，IC50 为 6.004 ng/mL，同时对沙丁胺醇的同系物克伦特罗（CL） 有 85.44%的交叉反应率，IC50 为 7.027 ng/mL，但对其他 β-兴奋剂类药物无交叉反应 性。 以该抗体为基础建立了同时检测沙丁胺醇和克伦特罗的间接竞争 ELISA 方法。 方阵滴定法确定包被抗原和抗体的最适工作浓度分别为 4 万倍和 8 万倍稀释。以抑制 率为纵坐标，分别以 SAL 和 CL 浓度的负对数为横坐标绘制标准曲线，针对 SAL 和 CL 的线性方程分别为 Y=-20.868X+96.359 和 Y=-20.77X+94.722。该 ELISA 方法对 SAL 和 CL 的最低检测限分别为 0.219ng/mL 和 0.253ng/mL。在空白猪肉和猪尿中按 1-50ng/g(mL)的浓度添加 SAL 和 CL 后，对 SAL 的添加回收率为 72.2%-87.8%，变异 系数分别为 4.6%-11.7%，对 CL 的回收率为 79.9% -97.4%，变异系数为 1.3%-13.5%。 以该沙丁胺醇抗体为基础，结合免疫胶体金技术，制备了快速检测沙丁胺醇和克 伦特罗的金标试纸条。试纸条直接浸入猪尿中即可在 5min 内用肉眼对结果进行判定， 阳性结果为一条红线，阴性结果为两条红线。试纸条对猪尿中沙丁胺醇和克伦特罗的 最小检出限分别为 2.0ng/mL 和 2.5ng/mL。 本研究以沙丁胺醇抗体为基础建立了一种快速，灵敏的ELISA方法，并研制了一 种简便、快速的沙丁胺醇免疫胶体金检测试纸条，以期能更加快速有效的监控养殖业 中沙丁胺醇和克伦特罗的非法使用，保障动物源性食品安全。 关键词：沙丁胺醇；克伦特罗；多克隆抗体；ELISA；胶体金 Study on the method for rapid multi-determination of β-adrenergic agonist Candidate：Zhang Yafeng Major：Basic Veterinary Medicine Advisors：Liu Juxiang、Wang Jianping Abstract β2 -adrenergic agonists have the effect of enhancing animal growth and increasing protein synthesis, which are used as feed additives in animal breeding. However, the residues of β2 -adrenergic agonists in animal tissues would be harmful to consumer, the residue detection was a important work assotiation of food safety. In this study, salbutamol (SAL) was coupled to bovine serum albumin (BSA) and ovalbumin (OVA) by use of mixed anhydride method and the carbodiimide method to prepare the immunogen and coating antigen, respectively. The coupling ratio of SAL with BSA was 12:1 and 6:1, respectively, and those of with OVA was 9:1 and 4:1, respectively. The immunogen was used to immunize the rabbits, and the anti-SAL antibody