γ-聚谷氨酸发酵关键技术的研究-微生物学专业论文.docxVIP

RESEARCH ON THE KEY TECHNOLOGY OF γ-POLYGLUTAMIC ACID FERMENTATION A Dissertation Submitted to the Graduate School of Henan University in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Science By Zhang Erchao Supervisor: Pro. Chen Shuangxi May, 2015 摘 要 γ-聚谷氨酸（γ-PGA）是微生物合成由谷氨酸单体缩合形成的高聚物，单体间以酰 胺键相互连接，具有多种优良特性，如无毒、生物可降解、生物相容、强溶于水等，广 泛用于食品、环保、农业等领域。本文从 γ-PGA 生产菌的诱变选育和发酵过程优化展开 研究，以期提高 γ-PGA 产率。主要研究内容如下： （1）采用 ARTP 技术对出发菌株 L13 进行诱变处理，诱变条件为：处理距离 2 mm、 最佳处理时间 300 s、样品加量 10 μL、通气量 10 SLM。以不产生脂肽和 γ-PGA 高产作 为筛选标准，从突变库中筛选获得一株性能优良的突变株 ZF5。通过摇瓶发酵与 5 L 罐 分批发酵验证，该菌株发酵过程仅产生少量泡沫，不产生脂肽副产物，在 5 L 罐中发酵 18h γ-PGA 产率达到 26.1 g/L。 （2）在对枯草芽孢杆菌 ZF5 发酵特性研究基础上，通过添加适量的金属离子、氨 基酸对 γ-PGA 发酵进行调控，以提高 γ-PGA 产率。结果发现：Ca2+、Mo6+能够促进菌 体的生长和 γ-PGA 的生物合成，最适浓度分别为 0.1 g/L 和 0.06 g/L；Zn2+对菌体生长和 产物合成都无显著影响；Cu2+和 Mn2+对菌体的生长有一定抑制作用，但是 Mn2+对 γ-PGA 产物积累促进作用最强，添加 0.3 g/L 的 Mn2+发酵 24 h γ-PGA 产率最高为 28.5 g/L，较 对照提高了 11.8%。谷氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸对 γ-PGA 的合成具 有促进作用，其中谷氨酸、天冬氨酸效果更为显著。在发酵初始添加 3 g/L 的 L-谷氨酸 可使 γ-PGA 产率提高 23%，最高达到 31.5 g/L；在稳定期添加 5 g/L 的 L-天冬氨酸可使 γ-PGA 产率提高 17.6%，达到 30.7 g/L。 （3）通过单一 pH 控制发酵策略研究发现，菌株 ZF5 最适生长 pH 为 6.5，产物 γ-PGA 积累的最适 pH 为 7.0。通过两阶段 pH 控制策略有效地实现了菌体快速生长和 γ-PGA 合 成最大化。在 5 L 罐中分批培养，前 10 h 将 pH 控制在 6.5，之后恒定为 7.0，菌体得以 快速生长，同时 γ-PGA 产率最高达到 32.6 g/L，较 pH 7.0 恒定发酵策略产率提高了 24.9%， 周期较短。 （4）结合 pH 分阶段控制策略，在 5 L 罐中采用分批补料发酵技术研究了葡萄糖、 酵母膏、谷氨酸钠补料对发酵过程的影响。结果表明：葡萄糖、酵母膏、谷氨酸钠的最 I PAGE PAGE IV III III 适初始浓度分别为 100、10、20 g/L，补加量分别为 100、10、50 g/L，对 γ-PGA 合成有 明显的促进作用。葡萄糖、酵母膏的最适补料时间为对数末期（约 17 h），谷氨酸钠的 最适补料时间为对数中期（约 14 h）。经过优化，γ-PGA 产率最高达到 52.3 g/L，发酵周 期 28 h，较分批发酵产率提高了 60.4%。 关键词：γ-聚谷氨酸，常压室温等离子体，诱变，分批补料发酵 ABSTRACT γ-Polyglutamic acid (γ-PGA) is an extracellular macromolecular peptide which composed of glutamic acids through γ-glutamyl bond. γ-PGA has many excellent properties such as nontoxicity, degradability, biocompatibility and outstanding solubility in water, and so on. Due to these, γ-PGA is widely used in food, environmental protection, agriculture and other fields. The paper researches on th